Problématique: Comme dans plusieurs pays du Sud, le suivi virologique des patients sous traitement antirétroviral (TARV) en Guinée est timide voire inexistant dans certaines localités. Le but de cette étude était d’évaluer la faisabilité technique et logistique de l’utilisation des DBS dans les tests de charge virale (CV) et de génotypage.

Méthode: De septembre à octobre 2010, les DBS ont été préparés à partir de prélèvements sanguins de patients adultes sous TARV. Le délai d’envoi des échantillons au laboratoire de référence était de 30 jours maximum après le prélèvement et se faisait à température ambiante. La CV a été quantifiée et les échantillons de patients en échec virologique (CV ≥ 3 log₁₀ copies/mL) ont été génotypés selon le protocole de l’ANRS. L’algorithme de Stanford version 6.0.8 a été utilisé pour l’analyse et l’interprétation des mutations de résistance.

Résultats: Parmi les 136 patients inclus, 129 et 7 étaient respectivement sous première et deuxième ligne de traitement avec une médiane de suivi de 35 mois [IQR: 6-108]. L’échec virologique a été noté chez 33 patients. Parmi eux, 84.8% (n = 28/33) ont bénéficié d’un génotypage. Le taux de résistance global était de 14% (n = 19/136). Le CRF02_AG était le sous type viral le plus prévalent (82%; n = 23)

Conclusion: En plus de montrer la faisabilité technique et logistique des tests de CV et de génotypage à partir des DBS, ces résultats montrent l’intérêt de leurs utilisations dans le suivi virologique des patients sous TARV. Cette étude a permis également de documenter l’échec virologique, la résistance aux ARV et la diversité génétique du VIH-1 en Guinée.

Mots clés: VIH-1, Résistance aux ARV, DBS (Dried Blood Spots), Guinée Conakry, Génotypage, Charge Virale.

Quantification of Viral load and resistance tests of HIV-1 to ARVs from dried blood spots samples in Guinean patients undergoing antiretroviral treatment.

Problem: As in several countries of the South, the virological monitoring of patients undergoing antiretroviral treatment (ARVT) in Guinea is low or non-existent in some locations. The aim of this study was to assess the technical and logistical feasibility of the use of (dried blood spots) DBSs in viral load (VL) and genotyping tests.

Method: From September 2010 to October 2010, DBS were prepared from blood samples of adult patients under ARVT. The samples had to be sent to the reference laboratory within 30 days after the sample had been done at ambient temperature. The VL was quantified and the samples of patients with virological failure (CV ≥ 3 log₁₀ copies/mL) were genotyped according to the ANRS protocol. The Stanford algorithm, version 6.0.8, was used to analyse and interpret the resistance mutations.

Results: Amongst the 136 included patients, 129 and 7 were under first and second line treatment respectively, and monitored for an average of 35 months [IQR: 6-108]. Virological failure was noticed among 33 patients. Among them, 84.8% (n = 28/33) benefited from genotyping. The global resistance rate was 14% (n = 19/136). CRF02_AG was the most prevalent viral subtype (82%; n = 23)

Conclusion: In addition to demonstrating the technical and logistic feasibility of VL and genotyping tests from DBSs, these results show the relevance of their use in the virological monitoring of patients under ARVT. Also, this study made it possible to provide information on virological failure, ARV resistance and the HIV-1 genetic diversity in Guinea.

En Guinée, la prévalence du VIH chez les adultes (15-49ans) est estimée à 1.4%.¹ La mise sous traitement antirétroviral (TARV) des patients vivant avec le VIH/SIDA a débuté en 1999. Depuis, le nombre de sites de prise en charge (PEC) opérationnels des patients répartis dans le pays a augmenté et est passé de 46 en 2012 à 51 en fin 2013. La couverture nationale en centres de Conseils et dépistage volontaire (CDV) était de 66 sites et 131 sites de prévention de la transmission mère-enfant (PTME) pour 464 structures offrant les services de consultations prénatales (CPN) en 2013.² De plus, la couverture en TARV a connu une hausse au cours de ces années et est passée de 22.50% en 2007 à 56.91% en fin 2011, pour 40 258 personnes éligibles au TARV selon les lignes directrices de l’OMS.³ A l’image de plusieurs pays à ressources limitées, du fait d’un manque d’infrastructures, d’équipements biomédicaux et de personnels qualifiés, les tests moléculaires, notamment la charge virale (CV) et le génotypage, ne sont pas tout le temps disponibles. Par conséquent, le suivi des patients sous TARV en Guinée se fait essentiellement en se basant sur des critères clinico-immunologiques.⁴ L’utilisation du papier buvard comme support de prélèvement sanguin alternatif au plasma permettrait la collecte et le transport des échantillons des sites périphériques vers le centre de référence national ou international. Le papier buvard (DBS) a été largement utilisé dans le diagnostic sérologique et moléculaire de l’infection à VIH.^5,6 De plus, les DBS ont été utilisés dans la détermination de la CV et des tests de résistance du VIH-1 aux ARV.^7,8,9 Plusieurs études ont évalué et validé le DBS en le comparant au plasma^10,11,12,13, qui est le type d’échantillon de référence pour les tests de CV et de génotypage. Le DBS est un support facile d’utilisation, moins exigeant que le plasma et le sérum car ne nécessitant pas une chaine de froid pour la conservation, le stockage et le transport des échantillons. C’est dans ce contexte que s’inscrit cette étude pionnière en Guinée dont l’objectif était d’évaluer la faisabilité technique et logistique des tests de CV et de génotypage du VIH-1 à partir d’échantillons DBS de patients sous TARV collectés dans des conditions de terrain.

Cette étude a porté sur des patients adultes (≥ 18 ans) sous TARV depuis au moins 6 mois, suivis dans le cadre du programme national. Les patients inclus dans cette étude ont été recrutés consécutivement sur la période allant de septembre à octobre 2010 au niveau de 4 sites de prise en charge (PEC). Les individus infectés par le VIH-2 ou coinfectés par le VIH-1 et VIH-2, de même que les femmes ayant bénéficiés d’une prévention de la transmission mère-enfant du VIH (PTME), n’étaient pas inclus. Le choix de ces sites a été fait de façon aléatoire et sur la base de l’existence d’association de personnes vivant avec le VIH pouvant faciliter la collecte des échantillons. Un des sites est situé dans la capitale, le Centre de Traitement Ambulatoire de Conakry, et les 3 autres sont localisés dans les régions de Boké, Mamou et Labé, distants respectivement de 300, 350 et 600 km de la capitale (Figure 1).

FIGURE 1: Répartition des sites de collecte des échantillons.

Pour chaque patient, 5 mL de sang total ont été recueillis dans un tube EDTA par ponction veineuse au niveau du pli du coude pour servir à la préparation de 2 cartes de papier filtre Whatman 903^®, conformément aux règles d’hygiène et de sécurité , et 50 µL de sang total ont été déposés sur chacun des 5 spots à raison d’une carte DBS, préalablement identifiée et datée. Les échantillons ont été séchés pendant la nuit à température ambiante (30 à 37 °C). Chaque échantillon DBS a été placé dans un sachet plastique individuel hermétiquement fermé en présence de dessiccateurs. Puis, ils ont été conservés et stockés sur site à température ambiante. L’envoi des DBS vers le laboratoire de Bactériologie Virologie de l’Hôpital Aristide Le Dantec de Dakar au Sénégal pour les tests de CV et de génotypage s’est fait par voie terrestre dans les 30 jours suivant le prélèvement.

A partir de 2 spots de chaque échantillon DBS/patients et à l’aide de l’appareil NucliSENS miniMAG (bioMérieux, Craponne, France), les acides nucléiques totaux ont été obtenus par extraction magnétique et manuelle selon la chimie de Boom.¹⁴ En effet, les spots découpés à l’aide d’un « puncher » dédié ont été trempés dans un tube contenant 2 mL de tampon de lyse et agité pendant 30 minutes à température ambiante. Les acides nucléiques ont été extraits et élués dans 25 µL de tampon d’élution après une série de centrifugation et des lavages avec des tampons 1, 2 et 3 comme précédemment décrit.¹⁰

La détermination de la CV a été effectuée à partir de l’extrait obtenu et ceci en utilisant kit NucliSENS EasyQ HIV-1 v2.0 (bioMérieux, Craponne,France) conformément aux instructions du fabriquant. La plateforme utilisée était NucliSENS® EasyQ (BioMérieux, Lyon, France) et le principe est une amplification de type NASBA. Le seuil de détectabilité de la technique est de 800 copies/mL.15 Dans cette présente étude, le seuil de l’échec virologique a été fixé à 3 log₁₀ copies/mL

Le génotypage a été effectué selon le protocole de l’ANRS (http://www.hivfrenchresistance.org/) qui consiste à faire des amplifications séparées par PCR des fragments de la protéase en entier et des 240 premiers codons de la reverse transcriptase (RT) du gène pol en utilisant respectivement les couples d’amorces 5’Prot1/3’Prot1 et MJ3/MJ4 comme amorces externes et 5’Prot2/3’Prot2 et A35/NE35 comme amorces internes. Les produits de PCR de 2^ème tour ont été purifiés avec le kit QIAquick Gel Extraction Kit®, (Qiagen, Courtaboeuf, France) conformément aux indications du fabriquant. L’ADN purifié a été directement séquencé sur la plateforme ABI Prism 3100 Avant (Genetic analyzer Applied Biosystem) selon la technologie du Big Dye Terminator Technology®v3.1 (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France). Les séquences obtenues ont été assemblées et manuellement éditées sur le logiciel SeqManTM II 5.08 de la suite de DNAstar® software (Lasergene, Konstanz, Germany). L’analyse et l’interprétation des mutations de résistance ont été réalisées sur l’algorithme de l’Université de Stanford version 6.0.8 (http://hivdb.stanford.edu/). Les séquences générées ont été alignées avec des séquences références du VIH-1 groupe M et l’ensemble des formes recombinant les CRFs disponibles sur Los Alamos hiv database (http://www.hiv.lanl.gov/content/index). Trois séquences de chaque sous-type pur ont été incluses dans l’alignement. Et les séquences ont été alignées avec l’algorithme de MUSCLE puis l’alignement dégapé obtenu a été avec le programme de Gblocks du logiciel SEAVIEW v4.4.1. L’arbre phylogénétique de Maximun de vraisemblance (PhyML) a été également généré sur SEAVIEW v4.4.1 avec comme paramètres supports de branche déterminés par la méthode approximate likelihood ratio test (aLRT), option SH-like. L’analyse de similarité et de bootscanning pour la confirmation des formes recombinantes (CRFs, URFs) a été effectuée sur le logiciel Simplot v3.5.1.^16,17 L’analyse et les calculs statistiques des données ont été réalisés avec les logiciels Epi Info v3.5.4 et Microsoft Excel.

Cette étude est une sous-étude d’un projet multicentrique impliquant 3 pays de l’Afrique de l’Ouest (Sénégal, Mali et la République de Guinée) et a été approuvée par les comités éthiques nationaux de ces pays. Les patients ont été recrutés consécutivement sur base volontaire, sur une période allant de septembre à octobre 2010 après signature d’un formulaire de consentement libre et éclairé. Pour garder confidentielles les données des participants, un code unique a été attribué à chaque prélèvement.

Au total 136 patients infectés par le VIH-1 sous TARV ont participé à cette étude. Parmi eux, 129 étaient sous traitement de première ligne (2INTI + 1INNRT) et 7 sous deuxième ligne (2INTI + 1IP/r), avec une médiane de suivi thérapeutique de 35 mois [IQR: 6-108 mois]. Le sexe ratio Homme/Femme était de 0,64 et l’âge médian était de 38 ans [IQR: 18-61 ans] Boîte 1.

L’échec virologique (CV ≥ 3 log₁₀ copies/mL) a été observé chez 33 patients soit un taux de 24.26% (n = 33/136). Parmi eux, 4 étaient sous deuxième ligne de TARV et 13/29 patients ont eu des changements de molécules de première ligne (exemple: d4T par AZT) pour des raisons cliniques ou de tolérance. Dans le Tableau 1, figurent entre autre l’historique du traitement et les données virologiques des patients en échec virologique. Selon la durée du traitement, 4/13, 7/31 et 22/92 patients étaient en échec virologiques respectivement à des intervalles 6-12, 13-24 et > 24 mois.

Au total, 28/33 échantillons de patients en échec virologique ont pu être génotypés soit un taux d’amplification réussi de 84.84%. La médiane de CV de ces échantillons de patients en échec virologique génotypés (n = 28) était de 4 log₁₀ copies/mL [IQR: 3-6.7] et celui des échantillons non amplifiés (n = 5) était de 3.1 log₁₀ copies/mL [IQR: 3-3.6] pour une p-value = 0.02. Au moins une mutation conférant une résistance à une molécule antirétrovirale a été observée chez 19 patients, soit un taux de résistance globale de 14%. La mutation M184V (n = 13) et les TAMs (Thymidine Analogue-Associated Mutations) (n = 32) étaient les plus fréquemment observées pour les INTI et la K103N (n = 11) et Y181C (n = 7) pour les INNTI. Leurs survenues étaient d’autant plus marquées que la durée du traitement était élevée (Figure 2). L’insertion T69 a également été observée chez 5 patients dont un en deuxième ligne. D’autres mutations comme la V198I, G190A/G et Y188A/L ont été également notées chez 4, 3 et 2 patients respectivement (Tableau 1). Par ailleurs, aucune mutation de résistance majeure aux IP (Inhibiteur de Protéase) n’a été observée et ceci qu’il s’agisse de patients avec une virémie supérieure à 3 log₁₀ copies/mL ou pas, de patients sous première ligne ou deuxième ligne de traitement.

FIGURE 2: Fréquences des mutations observées en fonction de la durée du Traitement.

L’analyse phylogénétique des séquences nucléotides a permis de montrer la prédominance du CRF02_AG, 82% (n = 23/28). Les sous types D et CRF06_cpx ont été observés dans les proportions respectives 7% (n = 2/28) et 11% (n = 3/28) (Figure 3).

FIGURE 3: Arbre PhyML montrant la relation phylogénétique entre les séquences requêtes (n=28, en traits pointillés) et les références (en traits pleins) dans la région du gène pol (PR+RT) du VIH-1.

Cette étude décrit pour la première fois en Guinée les données relatives à l’échec virologique et le taux de résistance du VIH-1 chez des patients sous TARV. Précédemment, dans des conditions relativement similaires à celles décrites dans cette étude, du fait que le plasma soit le type d’échantillon de référence pour la quantification de la CV et la réalisation des tests de résistance, nous avons effectué des études d’évaluation et de faisabilité des tests virologiques à partir d’échantillons DBS. Ce fut, d’une part, des comparaisons de valeurs de CV et de profils de résistance entre échantillons pairs plasma et DBS⁸ et, d’autres part, la faisabilité des tests de résistance à partir de DBS collectés et acheminés dans des conditions réelles de vie.¹⁰ Le but de cette présente étude était d’évaluer la faisabilité technique et logistique des tests de CV et de génotypage à partir d’échantillons DBS de patients sous TARV collectés dans des conditions de terrain. L’échec virologique a été observé dans 24.26% (n = 33/136) des cas et parmi eux 2/3 des patients étaient à plus de 24 mois de traitement (Tableau 1). Le taux de suppression virologique (75.7%) semble être satisfaisant pour une médiane de suivi de 35 mois.¹⁸ Garrido et al en 2008 ont rapporté un taux de suppression virologique similaire mais avec une médiane de suivi thérapeutique de 12 mois.⁷ Dans cette étude, nous avons obtenu un taux d’amplification réussi de 84.84% comparable à ceux obtenus en Tanzanie,¹⁹ en Espagne²⁰ et légèrement inférieur à ceux obtenus précédemment au Sénégal¹⁰ et en Guinée Conakry (94%).²¹ Cinq échantillons de patients en rebond virologique, dont la médiane de CV était faible (3.13 log₁₀ copies/mL [3.06-3.63]), n’ont pas pu être génotypés, malgré plusieurs tentatives. Ceci pourrait également être dû à une dégradation des acides nucléiques durant les processus de conservation et de stockage des prélèvements DBS à température ambiante. D’ailleurs, plusieurs études ont rapporté un faible taux d’amplification réussi pour des échantillons à CV < 5000 (3.69 log₁₀) copies/mL contrairement à ceux ayant des CV élevées (> 10000 [4 log₁₀] copies/mL).^20,22,23,24

Les mutations de résistances sélectionnées chez les patients en échec virologique dans cette étude (Tableau 1) étaient en accord avec les schémas thérapeutiques en cours ou antérieurs. La proportion de patients ayant ces mutations augmente avec la durée du traitement (14/19 ; supérieure à 24 mois). Par ailleurs, la mutation M184V conférant une résistance au 3TC/FTC et les TAMs pour les INTI et les mutations K103N et Y181C pour les INNTI (Figure 2), les plus prédominantes ici, ont été également celles observées dans plusieurs études conduites en Afrique subsaharienne.^7,25,26 L’insertion T69, conférant une multi-résistance aux INTI²⁷ et retrouvée chez certains patients, reflète la composition de leur régime thérapeutique, qui inclut soit la didanosine (ddI), soit la stavudine (d4T) ou encore la zidovudine (AZT). Ces molécules sont connues pour sélectionner la mutation T69.^28,29,30 Par ailleurs, les résultats de génotypage ont montré que 27.2% (n = 9/28) des patients en échec virologique étaient porteurs de virus sauvages (i.e. encore sensibles aux ARV). Cet échec virologique serait probablement lié à une mauvaise observance ou encore aux variants minoritaires que le ‘bulk sequencing’ utilisé dans cette étude ne peut pas détecter. Des observations similaires ont été rapportées à Abidjan (Côte d’Ivoire) et à Bangui (République centrafricaine).^31,32 Une virémie élevée sous TARV est associée à un risque d’émergence de la résistance du VIH aux médicaments. Ainsi, cette étude met en évidence la nécessité d’améliorer l’observance au traitement.

L’analyse phylogénétique des souches virales étudiées montre une forte prédominance du CRF02_AG (81%, n = 26), comme précédemment rapporté dans une étude de résistance primaire du VIH-1 chez des patients nouvellement infectés à Conakry.²¹

Ces résultats montrent la faisabilité technique et logistique des tests de CV et de génotypage à partir de prélèvements DBS. D’un autre côté, cette étude montre l’intérêt de l’utilisation des DBS comme support de prélèvement dans le monitoring virologique des patients sous TARV en Guinée, pays où le suivi virologique est encore peu structuré. De plus elle a permis de documenter le taux de patients en échec virologique, la résistance du VIH-1 aux ARV et la diversité génétique en Guinée.

Nous remercions l’Organisation Ouest Africaine de la Santé (OOAS) pour avoir financé cette étude, SOLTHIS Guinée (Solidarité Thérapeutique et Initiative contre le SIDA) pour son assistance, toutes les équipes de recherches ayant contribué à ce travail, l’ensemble du personnel des sites de PEC du Guinée, les différentes organisation des PVVIH/SIDA et les patients qui ont bien voulu participer à cette étude.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun lien financier ou personnel qui pourrait les influencer de façon inappropriée en écrivant cet article.

C.T.K. (Université Cheikh Anta Diop) était le chef de projet. C.T.K, H.D.N., A.A.M.D. (Université Cheikh Anta Diop) et M.C. (Service de Dermatologie CHU Donka, CTA, Conakry) étaient responsables de la conception expérimentale et de celle du projet. A.A.M.D. (Université Cheikh Anta Diop) et N.B. (Service de Dermatologie CHU Donka, CTA, Conakry) ont effectué les analyses virologiques et écrit le manuscrit initial. Tous les auteurs ont participé à sa rédaction et édition finales. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.