key: cord-1046229-3ykgftzp authors: Leruez-Ville, M. title: Diagnostic virologique des infections respiratoires(☆)() date: 2007-03-27 journal: Arch Pediatr DOI: 10.1016/j.arcped.2007.02.004 sha: a8aa395be3702d18e25730289069364952a2bf18 doc_id: 1046229 cord_uid: 3ykgftzp More than 80% of the cases of respiratory infections in children are of viral origin. Viral culture has been the reference method for the diagnosis of viral respiratory infections for years, but there is now a tendency to replace viral culture by molecular biology techniques, notably real-time PCR-based assay, because of its excellent sensitivity and good feasibility. Currently in most laboratories, however, diagnosis of viral respiratory infections is still done using techniques based on detection of viral antigens, especially immunofluorescence assays. Rapid diagnostic tests for use outside of laboratories are now available on the open market, and even if their sensitivity remains lower than that of other techniques, it is likely that they will become widely used, especially in doctors' offices, in the near future. New methods for the diagnosis of viral infections based on DNA microarray technologies are currently under investigation and appear to very promising. Les virus respiratoires sont responsables d'environ 80 % des infections respiratoires. Ils sont responsables d'infections respiratoires hautes (rhinite, laryngotrachéite) mais aussi d'infections respiratoires basses (bronchite, bronchiolite, pneumopathie) potentiellement sévères. L'incidence annuelle des pneumonies communautaires chez l'enfant de moins de cinq ans est de 34 à 40 cas 1000, bien supérieure à celle retrouvée chez l'adulte [6] . Il y aurait de 545 000 à 840 000 hospitalisations d'enfants chaque année aux États-Unis motivées par une infection respiratoire basse. Plus de 40 % de ces hospitalisations concernent des enfants de moins d'un an. Chez les enfants de moins de cinq ans, 90 % des hospitalisations pour infection respiratoire basse seraient liées à une infection virale, alors que dans la population des 5-18 ans seulement 39 % des infections respiratoires basses nécessitant une hospitalisation seraient d'origine virale [9] . Les virus responsables d'infection respiratoire sont différents selon la localisation anatomique de l'infection, l'âge et la période de l'année. De nombreuses études épidémiologiques ont été consacrées à la recherche des agents viraux responsables d'infection respiratoire dans la communauté. Ces études montrent une répartition saisonnière de certaines infections virales respiratoires : les infections à virus respiratoire syncytial (VRS) et la grippe surviennent uniquement l'hiver ; les infections à virus parainfluenza de type 3 [11] [12] [13] [14] . À côté de ces virus nouvellement décrits mais qui sévissent probablement depuis longtemps, des virus émergents le plus souvent issus d'une recombinaison génétique entre un virus animal et un virus humain de la même famille tels que le SARS sont une source de préoccupation majeure. Le prélèvement de choix pour réaliser le diagnostic d'une infection respiratoire chez l'enfant est le lavage-aspiration nasale à l'aide d'un dispositif stérile. Un prélèvement par écouvillonnage nasal est une alternative, cependant la sensibilité de détection des virus respiratoires serait un peu moins bonne avec cette technique de prélèvement [15] . Les virus peuvent aussi être recherchés dans des prélèvements pulmonaires notamment dans des liquides de lavage bronchoalvéolaire ou des fragments biopsiques. La technique de diagnostic la plus classique mais aussi la plus longue et la plus coûteuse est la culture cellulaire de virus. Elle consiste à inoculer les prélèvements respiratoires sur une nappe cellulaire et à guetter l'apparition d'un effet cytopathogène lié à la multiplication virale. Cet effet survient plusieurs jours voire plusieurs semaines après l'inoculation et retarde d'autant le diagnostic. Chaque virus ayant un tropisme cellulaire propre, il n'y a pas de système de culture universel et le laboratoire doit entretenir plusieurs lignées pour obtenir la multiplication d'un grand nombre de virus. Par exemple, les virus grippaux se multiplient sur cellules MDCK (rein de chien), les VRS et les adénovirus se multiplient sur des fibroblastes embryonnaires de poumon d'origine humaine, les virus parainfluenza sur les cellules en lignée Hep-2. Par ailleurs, pour obtenir une bonne sensibilité avec la culture cellulaire, le prélèvement respiratoire doit être acheminé rapidement au laboratoire ou prélevé dans un milieu de transport pour éviter que les virus ne soient inactivés. Malgré sa complexité, la culture cellulaire est longtemps restée la méthode de diagnostic de référence des infections respiratoires virales et les performances des autres outils diagnostiques ont été évaluées par comparaison avec cette technique. Les techniques de diagnostic des infections respiratoires reposent sur la mise en évidence des protéines virales directement dans les prélèvements. L'avantage majeur de ces techniques par rapport à la culture cellulaire est qu'elles peuvent être pratiquées sur un prélèvement dans lequel les virus sont inactivés, il y a donc moins de contrainte dans les délais d'acheminement au laboratoire. Deux types de techniques sont très utilisés : • l'immunofluorescence directe qui consiste à détecter la présence d'antigènes viraux dans les prélèvements à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques liés à la fluorescéine. Dans cette technique, les cellules respiratoires récupérées après centrifugation du prélèvement sont déposées dans les différentes cupules d'une lame, puis les anticorps monoclonaux spécifiques des virus respiratoires recherchés sont déposés sur ces cupules. Des inclusions vertes sont retrouvées dans les cellules infectées lors de la lecture des lames au microscope à fluorescence. Cette technique doit être réalisée par un technicien expérimenté, car la lecture des lames est souvent délicate, implique l'utilisation d'un microscope à fluorescence et reste réservée aux laboratoires spécialisés. La sensibi-lité de la technique d'immunofluorescence directe est généralement un peu inférieure à celle de la culture cellulaire ; • l'immunochromatographie sur membrane consiste à détecter la présence d'antigènes viraux à l'aide d'anticorps spécifiques (anti-VRS ou antigrippaux) adsorbés sur la membrane (Fig. 1 génique consistent à copier un segment du génome à l'aide d'amorces spécifiques. Les amorces s'hybrident avec la séquence nucléotidique homologue et l'enzyme la Taq polymérase qui est présente dans le milieu réactionnel recopie le fragment d'ADN, des étapes d'hybridation et d'amplification sont répétées de 30 à 40 fois ce qui permet d'obtenir de très nombreuses copies du segment nucléotidique cible. Dans une seconde étape, la présence des produits de PCR est visualisée le plus souvent sur un gel de polyacrylamide. Ces techniques de PCR sont très sensibles mais il existe un risque de faux positifs par contamination des échantillons, notamment au niveau de la deuxième étape de révélation. En effet, à cette étape, lors de l'ouverture des tubes qui contiennent une très grande quantité de produits de PCR (jusqu'à plusieurs millions), des microaérosols de produits de PCR se produisent et la pièce peut être contaminée. Récemment, une nouvelle technologie : la PCR en temps réel a révolutionné le diagnostic virologique. La technique de PCR temps réel consiste à réaliser une PCR en une seule étape en utilisant dans le milieu réactionnel à la fois des amorces permettant l'amplification mais aussi une sonde permettant la détection des produits de PCR au fur et à mesure de leur apparition. La sonde est marquée par un fluorochrome et une émission de fluorescence a lieu lorsque la sonde s'hybride avec l'ADN cible présent dans l'échantillon. L'émission de fluorescence est détectée à chaque cycle de PCR par la machine de PCR en temps réel ; la quantité de fluorescence émise est proportionnelle à la quantité de cible présente dans l'échantillon. Cette technologie a un triple avantage par rapport à la technique de PCR traditionnelle : elle évite les contaminations puisque le tube contenant les produits de PCR n'a pas besoin d'être ouvert, elle est quantitative et elle est très facilement automatisable. On peut par ailleurs réaliser des PCR dites multiplexes c'est-à-dire que dans un même tube plusieurs génomes viraux sont détectés grâce à la présence d'un mélange d'amorces et de sondes spécifiques de plusieurs virus. La sensibilité des techniques de PCR est bien supérieure à celle de la culture cellulaire, en effet la PCR permet d'identifier plus du double d'infections respiratoires virales [18, 19] par rapport à la culture. Cependant, en raison de cette grande sensibilité des techniques de PCR, certains ont discuté la valeur d'une PCR positive, notamment en posant la question d'un possible portage de virus dans le tractus respiratoire ne reflétant pas une infection active. La cinétique de détection des virus par PCR au décours d'un épisode d'infection respiratoire aiguë a été étudiée chez le sujet immunocompétent : la PCR reste positive dans les sécrétions respiratoires environ dix jours en cas d'infection grippale [20] et jusqu'à cinq semaines après une infection à rhinovirus [21] , mais à distance de l'épisode aigu (plus d'un mois) les PCR sont négatives. Par ailleurs, la détection de génome de virus respiratoire par PCR est peu fréquente chez les sujets asymptomatiques. Ainsi, la détection de l'ARN des rhinovirus est inférieure à 5 % chez des enfants asymptomatiques [22] ; et des données récentes obtenues au sein de population d'adultes montrent que la fréquence de détection de virus grippal ou du VRS par PCR chez des sujets totalement asymptomatiques en périodes d'épidémies de grippe ou de VRS est faible [23] . Ainsi, l'amplification du génome des virus respiratoires par PCR tend à devenir la nouvelle technique diagnostique de référence, notamment grâce à la diffusion des techniques de PCR en temps réel. D'ailleurs, les nouveaux outils diagnostiques et notamment les tests rapides sont maintenant validés en les comparant aux techniques de PCR. Cette technique repose sur l'utilisation de « puces » ou « chips » qui sont des cartes contenant une membrane sur laquelle sont déposées des sondes à ADN spécifiques des micro-organismes recherchés. On peut déposer sur une puce de très nombreuses sondes marquées (jusqu'à plusieurs milliers). Une lyse et une extraction des acides nucléiques sont réalisées à partir de l'échantillon biologique à analyser. Les acides nucléiques extraits sont ensuite déposés sur la puce, une hybridation a lieu entre le génome viral et l'ADN de la sonde spécifique prédéposée sur la membrane de la chip. La présence de l'hybridation est révélée après lecture informatisée de la puce. Cette technologie est très prometteuse, elle permettrait en effet de rechercher en une seule analyse la présence de l'ensemble des micro-organismes connus pour être responsables de pathologie respiratoire en utilisant une puce comprenant des sondes spécifiques de chacun de ces micro-organismes. Actuellement, la réalisation de puces est très onéreuse et leur utilisation en diagnostic médical n'est pas validée mais cette technologie semble promise à un bel avenir. Le diagnostic virologique des infections respiratoires communautaires reste actuellement réservé au cas d'infections sévères nécessitant une hospitalisation. En effet, dans ce contexte, le diagnostic virologique va aider à la prise en charge en permettant : • d'éviter une antibiothérapie potentiellement injustifiée ; • de traiter avec un antiviral spécifique notamment un antigrippal (Tamiflu ® ou Relenza ® ) ; • d'appliquer les mesures d'isolement strict tant que l'enfant excrète du virus afin de lutter contre les infections nosocomiales. Cependant, depuis l'arrivée sur le marché de deux antigrippaux efficaces se pose la question de l'intérêt potentiel de la pratique du diagnostic virologique de la grippe en ville. En effet, le Relenza ® et le Tamiflu ® sont des inhibiteurs de la neuraminidase virale qui : • permettent, lorsque le traitement est débuté dans les 24 heures qui suivent le début des symptômes, de raccourcir l'épisode grippal (à virus A ou B) d'une journée et demie ; • diminuent le risque de survenue d'otites moyennes aiguës de 45 % ; • diminuent la prescription d'antibiotique de 40 %. Ainsi, l'utilisation d'un traitement par un antigrippal devrait diminuer le coût de la grippe en termes de consommation médicale. L'enjeu actuel est d'évaluer s'il faut : • traiter systématiquement tous les cas de syndromes grippaux survenant pendant la période de l'épidémie de grippe et donc traiter en excès, on sait en effet que 30 à 40 % des syndromes grippaux survenant en pleine épidémie de grippe ne sont pas des infections à virus influenzae ; • ou s'il faut traiter uniquement les cas confirmés par un test rapide positif et dans ce cas traiter de façon insuffisante puisque comme nous l'avons vu les tests rapides ont une sensibilité médiocre et ne permettent le diagnostic que de 50 à 60 % des cas de grippe. Deux études coût-efficacité récentes indiquent qu'en période d'épidémie la stratégie du traitement systématique est celle qui permettrait la meilleure diminution des coûts [24, 25] . La technique de PCR et notamment de PCR en temps réel tend à devenir la technique de référence du diagnostic des infections respiratoires virales car elle s'avère beaucoup plus sensible que la technique de culture cellulaire. Les techniques les plus utilisées en routine dans les laboratoires restent les méthodes de diagnostic rapide par détection des antigènes viraux. Il est probable que l'on assiste dans les années à venir à la diffusion des techniques de type « doctortest » avec notamment une utilisation dans les services d'urgences hospitalières ou au cabinet médical. Par ailleurs, les techniques de puces à ADN qui sont actuellement au stade de développement paraissent très séduisantes car elles permettraient d'envisager un diagnostic de l'ensemble des micro-organismes responsables de pathologie respiratoires. A comparison of Binax NOW to viral culture and direct fluorescent assay testing for respiratory syncytial virus Comparison of an immunochromatography test with multiplex reverse transcription-PCR for rapid diagnosis of respiratory syncytial virus infections Evaluation of the QuickLab RSV test, a new rapid lateral-flow immunoassay for detection of respiratory syncytial virus antigen Evaluation of diagnostic tests for influenza in a pediatric practice Influenza virological surveillance in children: the use of the QuickVue rapid diagnostic test Community-acquired pneumonia in children Comparison of a new neuraminidase detection assay with an enzyme immunoassay, immunofluorescence, and culture for rapid detection of influenza A and B viruses in nasal wash specimens Evaluation of the Directigen FluA+B test for rapid diagnosis of influenza virus type A and B infections National disease burden of respiratory viruses detected in children by polymerase chain reaction Human metapneumovirus and lower respiratory tract disease in otherwise healthy infants and children Characterization and complete genome sequence of a novel coronavirus, coronavirus HKU1, from patients with pneumonia Identification of a new human coronavirus Human coronavirus NL63 Coronavirus HKU1 infection in the United States Comparative study of nasopharyngeal aspirate and nasal swab specimens for detection of influenza Near patient testing for influenza in children in primary care: comparison with laboratory test Comparison of Binax NOW and Directigen for rapid detection of influenza A and B Superiority of reverse-transcription polymerase chain reaction to conventional viral culture in the diagnosis of acute respiratory tract infections in children Influenza burden of illness: estimates from a national prospective survey of household contacts in France Simultaneous detection of influenza viruses A and B using real-time quantitative PCR Persistence of rhinovirus and enterovirus RNA after acute respiratory illness in children Human picornavirus and coronavirus RNA in nasopharynx of children without concurrent respiratory symptoms Detection of respiratory syncytial virus and human metapneumovirus by reverse transcription polymerase chain reaction in adults with and without respiratory illness Bedside rapid flu test and zanamivir prescription in healthy working adults: a cost-benefit analysis Treat or test first? Decision analysis of empirical antiviral treatment of influenza virus infection versus treatment based on rapid test results