key: cord-0920548-uyowkcli
authors: Lamoril, J.; Bogard, M.; Ameziane, N.; Deybach, J.-C.; Bouizegarène, P.
title: Biologie moléculaire et microbiologie clinique en 2007 Les applications et leur avenir – Partie 2
date: 2007-04-30
journal: Immuno-analyse & Biologie Spécialisée
DOI: 10.1016/j.immbio.2006.11.002
sha: 7b425749127b05ad3c800bc1d2aff613a0ee4810
doc_id: 920548
cord_uid: uyowkcli

Résumé La biologie moléculaire est omniprésente en biologie médicale et plus particulièrement en microbiologie. De nombreux articles démontrent son importance tant dans le domaine du diagnostic que du pronostic, de l'évaluation thérapeutique, de l'épidémiologie ou des risques biologiques naturels ou non. La quantité considérable d'articles sur ce sujet n'apporte pas toujours une réponse évidente sur le rôle de la biologie moléculaire dans un laboratoire de microbiologie qu'il soit hospitalier ou non. Cette revue constitue une synthèse des apports de cette discipline en microbiologie. À partir de cet état des lieux, certaines questions se posent, par exemple: la biologie moléculaire constitue-t-elle un réel apport en microbiologie? Dans quelles indications prescrire un examen de biologie moléculaire? Les réponses ne sont pas toujours simples. Elles sont évidentes dans certains cas (l'hépatite C par exemple) et le sont moins dans d'autres, la tuberculose par exemple. Dans la première partie de l'article, nous avons parlé des généralités appliquées à la microbiologie. Dans cette deuxième partie, nous abordons certaines applications, reflets de l'importance prise par la biologie moléculaire en microbiologie. Abstract Molecular biology is omnipresent in medical biology especially in microbiology. Many papers report studies on its importance in diagnosis, prognosis, therapeutic field, epidemiology, natural (or not) biological risks alike. The important sum of reports on this subject does not always bring an obvious answer to the part that molecular biology could play in a microbiology laboratory either public or private. This article summarizes the contributions of this specialized field in microbiology and brings some questions on its contribution. Is molecular biology a real progress in microbiology? What are the main indications of molecular biology today in this field? According to the infectious particle, the answers are not always simple. They can be obvious in some cases (for instance, hepatitis C) or less obvious in other cases (tuberculosis for instance). In the first part of this article, we reported general remarks in molecular biology related to microbiology. The second part report some important applications underlining the important extent of molecular biology in this field.

Depuis l'invention de la technique d'amplification par PCR (polymerase chain reaction) en 1983, la biologie moléculaire s'est implantée rapidement dans les laboratoires de microbiologie clinique. En effet, bien que de nombreuses techniques de microbiologie demeurent traditionnelles (examen direct, culture bactérienne, sérologie, tests biochimiques), la biologie moléculaire a pu trouver sa place en routine dans un grand nombre de laboratoires d'analyses médicales. L'étude des agents infectieux à l'aide des outils de biologie moléculaire est ainsi devenue indispensable dans certaines indications. Les applications sont nombreuses et impossibles à toutes décrire. Nous allons donc aborder quelques exemples d'applications et nous envisagerons ce que pourrait être la place prochaine de la biologie moléculaire dans l'avenir.

Tout agent infectieux peut être détecté en biologie moléculaire. La littérature abonde sur ce sujet démontrant ainsi ses énormes capacités. Néanmoins, en pratique courante que ce soit en milieu hospitalier (en dehors de la recherche) ou en pratique médicale de ville, les indications sont plus restreintes. Sans rentrer dans les détails de chacun des agents pathogènes les plus fréquemment recherchés par les outils de biologie moléculaire, nous aborderons les points se rapportant à la place de la biologie moléculaire pour certains d'entre eux.

Les virus sont le plus souvent détectés par des techniques développées au sein des laboratoires spécialisés en virologie. De ce fait, peu de virus ont fait l'objet de commercialisation de kits de détection [71] . Des kits ont cependant été développés dans des indications particulières (Tableau 1). Étant donné qu'il est impossible de détailler chacune d'entre elles, nous illustrerons notre propos de manière succincte par quelques exemples.

L'hépatite C (VHC) Le virus de l'hépatite C est un virus à ARN appartenant à la famille des Flaviviridae. L'infection par le VHC est un problème majeur de santé publique (au moins 400 000 porteurs chroniques du virus en France) (Fig. 1) . L'infection a donc essentiellement pour origine l'usage de substances (voie i.v. essentiellement), les expositions nosocomiales (endoscopie, sclérose de varice, hémodialyse, intervention chirurgicale), la transmission foetomaternelle, piqûre accidentelle (professions de santé), exceptionnellement sexuelle. Les expositions post-transfusionnelles sont devenues rares en France depuis 1992. Dans 15 % des cas, aucune cause n'est retrouvée. Détection et quantification du virus VHC. Les moyens diagnostiques classiques de virologie sont limités dans cette pathologie (sérologie, antigénemie). La sérologie (techniques Elisa et Riba) détecte les anticorps mais ne permet pas d'affirmer l'infection. Par ailleurs, ce groupe de technique peut donner des faux négatifs chez des individus immunodéprimés (par exemple, co-infection par le VIH, transplantés, hépatite C avec cryoglobulinémie). La recherche d'une antigénemie de capside peut également être réalisée. La biologie moléculaire permet donc d'affirmer l'infection par le virus à la phase aiguë, l'infection chez les sujets immunodéprimés, de confirmer le passage à la chronicité et aide à évaluer la réponse thérapeutique (Tableau 1). Les tests qualitatifs disponibles dans le commerce sont très sensibles. De manière générale, ils présentent un seuil de détection de 5-10 UI/ml. La PCR qualitative (mise en évidence de l'ARN viral) établit le diagnostic, atteste le passage à la chronicité, évalue la réponse thérapeutique et permet d'affirmer la guérison. Une recherche qualitative par PCR peut cependant être faussement négative dans certains cas tels que dans le cas d'une sérologie faussement positive ou une virémie intermittente. Néanmoins, en cas de sérologie positive, dans la majorité des cas, une recherche qualitative d'ARN négative permet de s'assurer de la guérison. Quant à la virémie (évaluée par la charge virale, quantification de l'ARN du virus), elle constitue un examen prédictif de la réponse thérapeutique et permet aussi d'évaluer le risque d'évolution vers une fibrose hépatique [62] . Dans le suivi thérapeutique, il est recommandé d'effectuer une recherche qualitative à la fin du traitement antiviral et six mois après la fin du traitement pour vérifier la réponse antivirale prolongée, voire la guérison. La charge virale est effectuée après 12 semaines de traitement. En absence d'une diminution de 2log 10 , on considère qu'il y a échec du traitement, ce dernier est arrêté. La virémie évaluée à 24 semaines, si elle est positive, induit l'arrêt du traitement (échec thérapeutique). De manière générale, sous traitement, la disparition de l'ARN viral affirme la réponse virale prolongée au traitement et le plus souvent la guérison.

De nombreux kits sont commercialisés. Selon les sociétés, différents systèmes de quantification sont utilisés (Tableau 1). La gamme de dosage varie selon les kits (Tableau 2). Progressivement, les techniques de PCR en temps réel remplacent les techniques de PCR « classiques » (RT-PCR et PCR compétitives) que ce soit pour un résultat qualitatif ou quantitatif [23] . [77] . Au cours des traitements par analogues nucléosidiques, l'objectif est d'obtenir une charge virale inférieure à 10 3 . Le génotypage du virus effectué par séquençage le plus souvent (méthode de référence) est parfois réalisé (Une charge virale minimum de 10 3 copies/ml est alors nécessaire). D'autres techniques sont aussi utilisables (Tableau 1).

Place de la biologie moléculaire dans l'hépatite chronique B en pratique. Avant tout traitement, le patient atteint d'hépatite chronique B doit avoir un génotypage viral et une charge virale, une bonne réponse à l'interféron pégylé étant associée à une charge virale inférieure à 10 7 copies/ml et un génotype A ou B (et des transaminases à trois fois la normale). En cas de traitement par les analogues nucléosidiques, la réponse thérapeutique est identique quel que soit le génotype viral. Dans le cas de l'entécavir récemment ajouté dans l'arsenal thérapeutique contre ce virus, les informations sont encore insuffisantes pour déterminer l'existence ou non d'une relation traitement-génotype.

Au cours du traitement, on considère qu'une baisse de la charge virale d'au moins un log 10 est significative. Celle-ci est évaluée trois mois après le début du traitement puis régulièrement tous les trois-six mois en fonction de l'état clinique du patient. En général, au cours des traitements par lamivudine ou par adéfovir dipivoxil, l'objectif est de maintenir la charge virale en dessous de 10 3 copies/ml. En effet, au-delà de ce chiffre, le risque d'acquisition d'une résistance au médicament est très important. Une remontée d'un log 10 de la charge virale confirmée par un deuxième prélèvement, évoque une résistance au traitement (les problèmes d'observance ayant été éliminés) [77] . Le typage des mutations à l'origine de cette résistance (actuellement réservé à certains laboratoires) peut alors être envisagé. Ce génotypage est d'autant plus important que pour certaines mutations du virus VHB, il n'existe pas de résistance croisée entre ces deux molécules.

Le VIH est un virus à ARN de la famille des rétrovirus. Il possède une transcriptase inverse (ou reverse transcriptase) qui permet la transcription de l'ARN viral en ADN proviral. Ce dernier peut s'intégrer dans le génome cellulaire. En fonction de l'hôte et des interactions cellulaires multiples, [42, 59, 67] . Dans l'hypothèse d'un changement de technique, il est indispensable de le préciser au médecin prescripteur. Le traitement du VIH repose sur l'association de plusieurs antirétroviraux, le but étant bien entendu la diminution maximale du virus (à ce jour, l'élimination totale du virus n'est pas possible). L'échec du traitement amène à considérer plusieurs causes (mauvaise observance, intolérance aux médicaments, interactions médicamenteuses, traitement antirétroviral insuffisant, résistance aux antirétroviraux). Cet échec en fait est souvent multifactoriel. Lorsque l'absence ou l'insuffisance de réponse thérapeutique est présente, on parle d'échec viral (EV) [21] . En addition de la clinique et des autres examens biologiques (notamment le taux de lymphocytes CD4), cet échec thérapeutique est apprécié sur la charge virale dont le taux varie significativement s'il varie de 0,5log 10 (c'est-à-dire d'un rapport de 3 en valeur absolue). Il est indispensable de savoir néanmoins que les infections intercurrentes ou les vaccinations peuvent transitoirement augmenter la charge virale. Il est également possible d'observer des élévations transitoires (< 1000 copies/ml) non significatives et aléatoires de la charge virale(appelées encore blips). L'EV est évalué après la mesure de deux CV à un mois d'intervalle. Plusieurs cas de figures sont possibles. Schématiquement, on peut considérer trois types de réponses :

• absence de réponse : diminution de la CV inférieure à 1log 10 copies/ml ; • réduction sub-optimale : valeur significativement diminuée mais sans atteindre « l'indectabilité » à trois mois ; • échappement virologique ou rebond : réapparition d'une CV après une période d'indectabilité.

L'intensité de la charge virale est appréciée selon le nombre de copies/ml.

• EV minime : 1000-5000 copies/ml ; • EV modéré : 5000 -30 000 copies/ml ; • EV majeur : supérieur à 30 000 copies/ml.

Le génotypage du VIH. Dans les cas de figure rapportés au paragraphe précédent, une recherche de résistance aux antirétroviraux doit être effectuée par génotypage du VIH. En pratique, le génotypage consiste à réaliser le séquençage du gène codant pour la reverse transcriptase (RT) et pour la protéase du virus (Fig. 2 ). Des kits de séquençage sont disponibles, la charge virale minimum pour effectuer ces techniques étant de 1000 copies/ml (Tableau 1). Leurs performances sont équivalentes. Actuellement, environ une cinquantaine de mutations sur la RT et une trentaine sur la protéase sont connues. Des algorithmes d'interprétation sont disponibles pour une prise de décision en fonction du résultat obtenu (disponible par exemple, sur le site www. hivfrenchresistance.org/tab2005.html). Un contrôle de qualité européen a été mis en place. Par ailleurs, il n'existe pas actuellement de kit pour séquencer le gène d'enveloppe (cible des inhibiteurs de fusion). Dans ce dernier cas, chaque laboratoire développe sa technique maison. En règle générale, ces techniques de génotypage permettent l'analyse de la population majoritaire présente dans le sang circulant (les populations minoritaires sont ignorées). Le cytomégalovirus (CMV). Après une infection, le CMV, virus de la famille des herpès virus, persiste dans l'organisme dans les leucocytes du sang circulant à l'état latent. La réactivation du virus est observée chez les sujets immunodéprimés (sida, transplantation d'organes) et aboutit à une infection grave. Il est donc important de détecter rapidement et précocement ce virus dont l'infection est potentiellement létale. Par ailleurs, le CMV est la cause principale d'infection intra-utérine et atteint 0,3-2 % des nouveau-nés, le risque majeur pour ces derniers se situant dans les 16 premières semaines de la grossesse. Néanmoins, la biologie moléculaire n'est positive que de manière inconstante dans les primo-infections à CMV au cours de la grossesse (risque de transmission de 20-50 %). La biologie moléculaire ne semble donc pas utile dans cette indication [39] . Par ailleurs, la mise en évidence qualitative du virus dans le sang n'a aucune valeur indicative. En effet, elle ne permet pas de distinguer une infection latente (silencieuse) d'une infection active. La mesure de la quantité de virus (la charge virale) permet d'évaluer la gravité de l'infection, son pronostic et d'adapter le traitement. Des kits sont disponibles pour mettre en évidence le virus ou le quantifier (Tableau 1).

Les papillomavirus humains (HPV) sont des virus à ADN de la famille des Papovaviridae. Environ 100 types d'HPV sont répertoriés à ce jour dont une trentaine ont un tropisme pour la sphère anogénitale et sont considérés comme agents coresponsables des cancers du col de l'utérus (risque multiplié par 300-500) [6] . On estime qu'environ 15 % des cancers seraient d'origine infectieuse, HPV étant à l'origine de 30 % d'entre eux (parmi les autres agents infectieux reconnus inducteurs de cancer, on peut citer des virus comme HBV, HVC, EBV ou certaines bactéries comme Helicobacter pylori) [44] . Selon les génotypes des virus HPV, certains sont considérés à bas risque (cf. 6 [15, 56, 69] . L'infection par HPV est une infection sexuellement transmissible fréquente (la prévalence est estimée à 80 % chez les femmes de 18 à 22 ans) et dans la majorité des cas, transitoire. Chez les femmes de plus de 30 ans, la prévalence est faible mais le risque de portage chronique important. Or, la menace d'une persistance de l'infection par un type HPV à haut risque est un facteur majeur d'évolution vers un cancer du col (huit ans sont nécessaires pour le développement d'une lésion invasive après l'infection). Ce cancer représente en France la huitième cause de cancer en incidence et la cinquième cause de cancer en mortalité. Dans plus de 95 % des cancers intraépithéliaux du col de l'utérus, l'ADN HPV est retrouvé, les génotypes 16 et 18 étant les plus fréquents. L'adénocarcinome du col utérin est moins fréquemment associé au HPV, le génotype 18 étant le plus fréquent de même que dans le cancer du col à petites cellules. La recherche du HPV est possible dans certaines conditions en association avec le frottis cervical en cas d'anomalie au niveau du col utérin. L'Anaes a publié un avis en 2004 sur l'intérêt de la prescription de test ADN pour la recherche du HPV [4] . Ce rapport n'a malheureusement pas donné de réponse concise et claire. D'autres auteurs ont proposé des indications concrètes de recherche de l'ADN HPV [9, 23] . Actuellement, ce test est effectué chez les patientes présentant au frottis du col des cellules malpighiennes atypiques de signification indéterminée (cellules ASCUS, atypical squamous cells of undetermined significance) dont le degré de gravité est mal connu (environ 2-3 % des frottis). La mise en évidence d'ADN HPV permet alors de reconnaître les lésions cervicales néoplasiques intraépithéliales de haut grade. Certaines données récentes amènent à penser que le test serait utile pour les femmes de plus de 30 ans en association avec un frottis cervicovaginal en préventif, les études ayant montré dans ce cas une sensibilité de détection de quasiment 100 %. Certains auteurs proposent de coupler systématiquement frottis et détection de l'ADN HPV dans le dépistage systématique [53] et d'autres uniquement le dépistage par recherche de l'ADN HPV [19] . Un kit de détection et génotypage viral est disponible (Tableau 1). En cas de positivité, une colposcopie avec biopsie est effectuée. Il n'existe cependant aucun consensus lorsque le virus est retrouvé (avec un génotype classé à haut risque) et qu'aucune lésion histologique n'est mise en évidence (mais, il existe un grand nombre de frottis cervicaux faussement négatifs, la sensibilité du test étant d'environ 65 %). Une surveillance accrue semble indispensable dans ce cas, notamment, si un HPV de haut risque (cf. 16 ou 18) est présent, le risque de développer une lésion maligne étant important [9] . Ce test ne semble pas avoir d'intérêt dans le suivi thérapeutique des patientes. Cela est cependant discuté par certains auteurs [9] . Des tests de quantification du virus HPV, notamment du type 16 par PCR en temps réel à partir du frottis ont été décrits [27] et ont démontré dans certains cas (contredits par d'autres études) l'intérêt de la quantification pour différencier les infections à haut risque de cancer de celles à risque faible, voire nul [20, 43] .

Tout virus de séquence connue est détectable par amplification génique, la PCR demeurant la technique la plus pratiquée. À titre d'exemple, le Tableau 3 donne quelques exemples de virus détectés par PCR en temps réel.

Chlamydia trachomatis (CT) et Neisseria gonorrhoeae (NG) Les infections à CT et NG sont parmi les infections sexuellement transmissibles les plus fréquentes dans le monde. Depuis les années 2000, ces infections (associées à la syphilis et la lymphogranulomatose vénérienne) sont en constante augmentation [33] . Une étude réalisée aux États-Unis a montré qu'environ 4 % de la population des jeunes de 18-26 ans étaient infectés par CT et 0,4 % par NG [50] . En France, la prévalence serait plus importante comprise entre 10 et 18 % dans la population la plus atteinte soit les jeunes d'environ 15-30 ans [2, 3] . Ces deux infections présentent un polymorphisme clinique important avec atteinte possible de l'utérus, de l'urètre, du rectum, de l'oropharynx, de la conjonctive oculaire. Ces infections sont souvent asymptomatiques (environ 50 % des cas pour CT). Elles peuvent se présenter sous forme d'uréthrite ou de cervicite. Chez la femme, ces deux infections peuvent atteindre la sphère génitale haute et provoquer une atteinte inflammatoire du pelvis, une endométrite, une salpingite ou une périhépatite et aboutir à la stérilité, à des douleurs chroniques ou une grossesse extra-utérine. Chez l'homme, ces deux infections donnent une urétrite qui peut évoluer vers l'épididymite pouvant devenir chronique et provoquer une stérilité. Dans les deux sexes, NG peut évoluer vers une diffusion plus large avec arthrite, méningite ou endocardite. CT peut aussi être responsable de proctite ou d'un syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter (rhumatisme inflammatoire aigu ou subaigu associé à une atteinte oculaire et urétrale). Par ailleurs, certaines souches de CT (sérovars L1, L2, L2a et L3) sont responsables d'une maladie plus rare mais dont la prévalence augmente significativement depuis quelques années, la lymphogranulomatose vénérienne responsable de lésions génitales ulcérées, transitoires se compliquant de lymphadénite, rectite, fistule et évoluant vers la chronicité. Par ailleurs, la transmission foetomaternelle est possible pour CT et NG. Chez le nouveau-né, CT peut provoquer une conjonctivite ou une pneumonie et NG, une conjonctivite sévère, voire une septicémie. L'ensemble de ces éléments montre l'importance en termes de santé publique de ces infections et la nécessité de les dépister précocement [2] . Bien que la plupart des kits puissent détecter en même temps CT et NG (Tableau 1), nous les traiterons séparément pour des raisons didactiques. CT et biologie moléculaire. CT est un organisme intracellulaire dont la croissance en milieu de culture est difficile [32] . Considérée auparavant comme la technique de référence (réservée à quelques laboratoires spécialisés), cette technique est longue (résultat en trois-sept jours) et coûteuse. Bien que sa spécificité soit de 100 %, elle présente une faible sensibilité (40- [12] . Pour déceler une mycobactérie, les méthodes traditionnelles de diagnostic telles que l'examen direct des crachats (après coloration à l'auramine ou de Ziehl-Nielsen) nécessitent au moins 10 4 bacilles alcoolorésistants/ml. Cet examen, par ailleurs, ne permet pas de trancher entre MT et les autres mycobactéries. La culture permet d'affirmer l'infection par MT et représente l'examen de référence (gold standard) pour affirmer le diagnostic. Malheureusement, pour obtenir un résultat, la culture sur milieu de Lowenstein-Johnson nécessite quatre à six semaines. De plus, l'examen des crachats ou des lavages bronchoalvéolaires nécessite au préalable une décontamination par du N-acétyl-L-cystéine et de la soude, ce qui provoque une baisse sensible du nombre de bactéries. L'utilisation d'un automate de détection (système BacT/ALERT™ ou le système Bactec™ par exemple) permet d'augmenter la sensibilité de détection en ramenant le temps de diagnostic à 12-14 jours environ. D'autres méthodes telles que la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase gazeuse ou la technique Elisa n'ont pas amélioré la détection [57] . La question s'est alors posée de l'indication de la biologie moléculaire dans ce contexte.

Apports et limites de la biologie moléculaire dans la tuberculose. Étude dans les échantillons cliniques. Un diagnostic précoce est important pour un traitement efficace [47] . Certains kits ont donc été développés dans le but d'obtenir un diagnostic rapide de la tuberculose pulmonaire (Tableau 1). Ces tests se sont révélés très performants lors d'études sur les crachats positifs après coloration spécifique (sensibilité supérieure à 95 %, spécificité 100 %). Sur les échantillons négatifs après coloration, la sensibilité est moins bonne (80-85 %) alors que la spécificité reste excellente (99 %). Par ailleurs, de nombreux auteurs ont rapporté leur expérience à l'aide de développement personnel d'outils de recherche par biologie moléculaire (technique « maison »). Certaines études ont comparé les kits et les techniques « maison » et ont retrouvé des résultats équivalents [13] . Depuis la commercialisation de kits spécifiques, la place de la biologie moléculaire a été régulièrement discutée dans les nombreux essais réalisés [13, 57] [75] . Il ne faut donc jamais utiliser les tests d'amplification génique chez des patients traités, le risque de faux positif pouvant être important. Certains ont évalué la charge bactérienne mais n'ont pas mis en évidence d'intérêt à cette étude tant sur le plan pronostic que sur celui de l'évaluation thérapeutique [49] . Identification des mycobactéries en milieu de culture. En revanche, la mise en évidence de mycobactéries sur milieux de culture par identification directe à l'aide de sondes spécifiques semble beaucoup plus intéressante. Un certain nombre de kits ont été développés dans ce but (Tableau 1). Selon les kits, une ou plusieurs espèces de mycobactéries peuvent être identifiées. Le développement de puces d'ADN permettant à la fois l'identification de mycobactéries et l'étude de résistance aux antibiotiques a aussi été décrit [30] .

Étude des résistances aux antibiotiques. Les dernières études en France montrent un taux de multirésistance des mycobactéries d'environ 1,4 %, taux similaire à ce qu'on retrouve dans le reste de l'Europe avec une forte proportion pour l'isoniazide et la rifampicine [65] . Bien que faible, cette prévalence semble augmenter d'année en année depuis 2000. La biologie moléculaire à l'instar de ce qui est réalisé pour les virus permet d'étudier ces résistances en analysant les gènes responsables. Pour permettre l'étude de résistances, il est cependant nécessaire d'obtenir suffisamment de mycobactéries. Certains automates (par exemple, de la gamme Bactec™) permettent ainsi de détecter les mycobactéries à partir du quatrième jour de culture. Parmi les techniques d'analyse, la biologie moléculaire a démontré sa capacité à réaliser ces tests soit en kits (Tableau 1) soit à l'aide de techniques maison (cf. séquençage, pyroséquençage, PCR-RFLP, PCR en temps réel). Ils sont cependant réservés à quelques laboratoires spécialisés. Plusieurs gènes de résistance peuvent être étudiés par exemple les gènes rpoB (rifampicine), katG (isoniazide), embB (éthambutol), gyrA (fluoroquinolone) [73] . Néanmoins, ces tests moléculaires ne doivent en aucun cas remplacer les tests phénotypiques dont ils sont complémentaires. En effet, la complexité des mécanismes de résistance impliqués rend indispensables les tests phénotypiques.

Enquêtes épidémiologiques. Les études épidémiologiques sont importantes dans certains cas, notamment en zone d'épidémie ou d'endémie. Parmi les techniques d'analyse, la PCR-RFLP de la séquence d'insertion IS6110 du complexe Mycobacterium tuberculosis est la plus utilisée. Cette séquence est une séquence répétée retrouvée en moyenne en cinq dix exemplaires dans les mycobactéries. Néanmoins, dans certains cas, cette séquence n'est pas présente, ce qui nécessite l'analyse d'autres cibles [14] .

Comme cela a déjà été dit dans cet article, tout agent infectieux peut être mis en évidence par les outils de biologie moléculaire. Bien que de nombreuses techniques d'amplification existent, la principale technique utilisée reste la PCR. Le Tableau 3 donne quelques exemples de bactéries détectées par des techniques « maison » par PCR en temps réel. De manière générale, la biologie moléculaire présente de nombreux avantages sur la culture souvent considérée comme la technique de référence. En effet, la biologie moléculaire est plus rapide et plus sensible que la culture. Cependant, selon les échantillons, la PCR présente quelquefois certaines limites. En effet, certains échantillons possèdent des inhibiteurs qui peuvent être difficiles à éliminer (par exemple, crachats, urines, fèces). Parmi les indications utiles de la biologie moléculaire en bactériologie, on peut citer : • la centrifugation par gradient de densité ;

• la filtration : après lavage du filtre, l'agent bactérien peut être recherché directement sur le filtre ; • la diélectrophorèse : des bioparticules diélectriques permettent la séparation de particules en fonction de leur conductivité dans un champ électrique non uniforme ; • la séparation par particules immunomagnétiques.

L'extraction des acides nucléiques est ensuite l'étape obligatoire. Certains systèmes ont été adaptés pour la détection rapide d'acides nucléiques. C'est le cas par exemple du système GeneXpert ® de la société Cypheid qui réalise dans une cartouche à usage unique toutes les étapes depuis l'extraction jusqu'à la révélation après PCR en temps réel de la cible recherchée. L'ensemble de ces étapes s'effectue en 30 minutes environ. Ce système a notamment été adapté pour Bacillus anthracis (le bacille de l'anthrax). D'autres systèmes ont aussi été développés mais ne sont pas aussi rapides (par exemple, l'automate d'extraction MagNaPure ® suivi d'amplification sur le LightCycler ® de la société Roche).

Les échantillons selon leur origine peuvent nécessiter des traitements différents :

• la nourriture : les aliments étant d'origine variée, il n'existe pas de système universel de préparation. Dans ces derniers, la présence de lipopolysaccharides, de lipides ou d'acides divers peut, en effet, inhiber la PCR. En dehors d'une culture des aliments (préalable à une PCR), méthode d'amplification naturelle lente, les autres méthodes de purification comme celles décrites cidessus ne sont pas toujours suffisantes pour mettre en évidence la cible recherchée ; • l'eau : il est nécessaire là aussi de concentrer l'eau pour recueillir la cible. Malheureusement, dans ce système, les inhibiteurs sont aussi fréquents (par exemple certains sels, les acides humiques). L'ultrafiltration est alors souvent utilisée pour retenir les agents pathogènes ; • les poudres et les sols : la recherche de spores est souvent difficile (par exemple, spores de Bacillus anthracis). Des techniques efficaces [45] et des kits ont été développés dans ce but [41] ; • les aérosols : selon la taille des particules, l'utilisation de filtres et/ou de liquides ou de supports semi-solides sont utilisées [68] ; • les surfaces : l'utilisation d'un chiffon ou d'un écouvillon humide permettent de recueillir un agent pathogène (par exemple, des spores). Des systèmes d'aspiration et de centrifugation permettent aussi ce recueil [41] .

Bien qu'un certain nombre de kits aient été développés en microbiologie, peu de kits l'ont été dans le cadre d'une menace bioterroriste (Tableau 1). On retrouve, en revanche dans la littérature de nombreuses références sur ce sujet [41] . Les cultures bactériennes par exemple, ne sont pas optimisées pour la détection d'agents bioterroristes. Des stratégies diverses ont été développées pour cette détection (voir le site du CDC www.bt.cdc.gov/labissues/index. asp#testing). Des automates, des systèmes immunologiques ou chimiques ont aussi été décrits [41] . Nous ne les détaillerons pas. En biologie moléculaire, des systèmes de PCR en temps réel ont été développés, notamment pour la détection de Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Escherichia coli O157: H7, Salmonella sp, Brucella sp, Listeria sp, le virus de la dengue, smallpox virus [41] . C'est le cas par exemple du kit PathAlert™ de la société InVitrogen. La plupart des appareils commercialisés (par exemple, LightCycler ® , la gamme des ABI7000™, le système GeneXpert ® ) ainsi que les kits sont utilisables en laboratoire. Ils présentent tous l'inconvénient majeur de ne pas pouvoir être utilisable « en rase campagne » (ce ne sont pas des appareils de terrain). Certaines sociétés ont cependant adapté certains thermocycleurs pour être utilisables en zone hostile (thermocycleurs portables pour PCR en temps réel). C'est le cas par exemple du thermocycleur RAPID™ (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device) de la société Idaho Technologies (États-Unis) ou le thermocycleur Bio-Seq™ de la société Smiths Detection (États-Unis). Il s'agit de thermocycleurs ultrarapides capable de donner en théorie une réponse en 30 minutes après extraction de l'acide nucléique.

Ainsi, le développement de la biologie moléculaire dans le cadre du bioterrorisme reste peu développé et peu décrit dans la littérature scientifique. Il reste donc beaucoup à faire dans ce domaine. En plus, l'évaluation de ces techniques moléculaires « en grandeur nature » n'a pas été réalisée à notre connaissance. De nombreuses questions restent donc en suspend. Quelle est la meilleure technique à utiliser selon l'échantillon suspecté ? Comment détecter très rapidement plusieurs agents potentiels en même temps ? Comment mettre en évidence un agent pathogène non caractérisé ?

Les infections par champignons sont de plus en plus importantes en milieu hospitalier, notamment les mycoses invasives opportunistes. Quant aux mycoses cutanées, elles sont fréquentes et ne posent en général pas de problème diagnostique. En effet, le diagnostic est alors réalisé par les méthodes traditionnelles telles que la culture, l'identification en galeries (panels enzymatiques et biochimiques), voire l'histologie (dans ce dernier cas, l'identification précise de l'agent pathogène n'est pas toujours réalisable). À l'opposé, les mycoses invasives sont de diagnostic plus difficile et les techniques habituelles manquent souvent de sensibilité et de spécificité (par exemple, 50 % de sensibilité pour l'hémoculture). La biologie moléculaire peut donc trouver une place comme moyen diagnostique dans ce contexte [7, 8] . Elle peut aussi être utilisée dans les études épidémiologiques (infections opportunistes), le typage des souches, l'étude de la résistance aux antimycosiques. Malheureusement, peu de kits ont été développés dans cette indication (Tableau 1) [17] . De nombreux champignons sont responsables de pathologie humaine le plus souvent dans le cadre de sujets immunodéprimés (cf. transplantation d'organe, sida, chimiothérapie anticancéreuse), les plus fréquents étant Aspergillus sp, Candida sp et Pneumocystis sp. Ainsi, on estime qu'environ 30 % des aspergilloses invasives ne sont pas diagnostiqués [8] . Cinquante pour cent seulement des aspergilloses sont diagnostiqués après culture de liquide bronchoalvéolaire. Il en est de même pour la recherche de Candida sp dans le sang après culture [8] . Bien que toutes les techniques de biologie moléculaire soient applicables à l'étude des champignons (électropho-rèse en champs pulsé, séquençage de gènes d'ARNr par exemple) [40] , ces dernières années, la PCR en temps réel a permis de développer efficacement et avec une plus grande sécurité (moins de risque de contamination) la recherche de certains champignons fréquemment retrouvés tels que Aspergillus sp (cf. fumigatus, niger, flavus), Candida sp (cf. albicans, glabrata, krusei), Pneumocystis carinii (ou jiroveci)i, cryptococcus sp [24] . Les tests d'amplification peuvent être effectués soit à partir de colonies isolées de milieux de culture soit à partir d'échantillon biologique (le plus souvent, le sang total). Cependant, les nombreuses techniques décrites depuis l'extraction des acides nucléiques jusqu'à la PCR n'ont pas abouti à ce jour à une standardisation des techniques d'étude des champignons. La sensibilité et la spécificité des tests sont variables selon la cible amplifiée et la technique (par exemple, sensibilité de 50 à 70 % pour la détection de Aspergillus sp) [63] . De nombreux autres problèmes se posent, notamment pour interpréter les résultats. En effet, certains champignons pouvant faire partie de la flore commensale (cf. Candida albicans), la mise en évidence de l'ADN du champignon ne signifie donc pas systématiquement son implication dans la pathologie. Par ailleurs, la mise en évidence d'ADN fongique dans les échantillons peut être la conséquence d'un champignon nécrosé (donc, non viable). D'autre part, pour certains auteurs, lors de prélèvements de liquide bronchoalvéolaire (en cas de suspicion d'aspergillose par exemple), il est possible d'avoir de faux positifs, des spores ou des conidies de ce champignon pouvant se trouver à l'air libre et contaminer l'échantillon. La quantification des acides nucléiques peut alors se discuter afin de trancher sur le lien de cause à effet en cas de positivité [8] . Ce problème ne se rencontre pas en cas d'analyse du sang total. Il est donc nécessaire d'être prudent dans cette recherche et surtout dans l'interprétation (risque de faux positifs). Par ailleurs, pour limiter encore le risque de faux positifs, certains préconisent l'utilisation d'automates d'extraction [8] . Pour d'autres, l'association de tests de biologie moléculaire à des tests immunologiques (par exemple, le test au galactomannane pour l'aspergillose ou les tests Elisa) permettrait d'établir le diagnostic [35, 63, 72] .

Les parasitoses constituent un problème majeur de santé publique dans le monde. Elles sont couramment diagnostiquées par les méthodes traditionnelles (cf. examen direct, coproculture, tests immunologiques). La biologie moléculaire s'est également développée dans ce domaine. Malheureusement, peu de kits sont disponibles (Tableau 1). Par ailleurs, on retrouve essentiellement dans la littérature des tests « maison ». De plus, il n'existe pas de standardisation internationale. Parmi les nombreuses publications rapportées, certains parasites sont plus fréquemment étudiés. Nous les évoquerons brièvement [8] . Le paludisme (Plasmodium sp). Il s'agit d'un problème majeur de santé publique. En France, cette pathologie se retrouve chez les touristes et les migrants avec une fréquence croissante. Le diagnostic habituel est simple (frottis et goutte épaisse) et permet en 30 minutes d'établir le diagnostic. Néanmoins, des faux négatifs sont possibles. La sensibilité de la goutte épaisse est environ de 50-500 parasites/μl [54] . Avec la PCR, cette sensibilité peut descendre à cinq-dix parasites dans le volume testé quel que soit le plasmodium responsable. Le résultat peut être rendu en deux heures (extraction incluse) [66] . Cependant, la PCR ne permet pas de différencier les quatre principales espèces de plasmodium (la cible amplifiée est commune aux quatre espèces). La corrélation avec l'étude au microscope est excellente. La PCR en temps réel permet aussi la quantification du parasite. Cependant, pour l'instant, la corrélation avec la parasitémie analysée au microscope est faible [24] . D'autres techniques d'étude moléculaire des parasites ont été développées, nous ne les détaillerons pas [52] . De plus, à l'heure actuelle, les techniques de biologie moléculaire ne sont pas accessibles dans les régions tropicales situées en zone d'endémie (hors de quelques grandes villes), le matériel et les infrastructures étant trop coûteux. Les techniques traditionnelles restent donc toujours les références, la biologie moléculaire étant réservée aux grands centres spécialisés. La toxoplasmose (Toxoplasma gondii). La toxoplasmose, parasitose endémique dans le monde entier, est une pathologie potentiellement grave chez le sujet immunodéprimé (cf. greffe de moelle, sida) et chez la femme enceinte. Le diagnostic peut être porté par la sérologie et éventuellement confirmé par inoculation à la souris. La sérologie permet d'évaluer le risque de transmission foetomaternelle et de réactivation chez le sujet immunodéprimé. Actuellement, lors d'une forte suspicion de transmission foetomaternelle dans le cadre d'un diagnostic prénatal, l'étude du liquide amniotique par PCR a remplacé la technique classique d'inoculation à la souris dans de nombreux laboratoires spécialisés [70] . Chez les sujets immunodéprimés, la recherche de l'ADN du parasite par PCR dans le sang total permet un diagnostic rapide. D'autres échantillons biologiques ont aussi été étudiés pour la recherche du parasite (cf. humeur aqueuse, LCR, liquide bronchoalvéolaire). Il n'existe cependant pas de kit et les techniques de PCR ne sont pas standardisées. Des contrôles de qualité sont disponibles pour permettre une homogénéisation des techniques et des cibles amplifiées (cf.www.qcmd.org). Outre le diagnostic de l'infection, la biologie moléculaire a aussi été utilisée dans le cadre d'études épidémiologiques [70] . Autres parasitoses. Comme exemples de parasites étudiés par biologie moléculaire dans la littérature, nous citerons ceux responsables des leishmanioses (Leishmania sp), de la babésiose (Babesia sp), des trypanosomiases (Trypanosoma sp), des giardiases (Giardia sp), de la trichomonase (Trichomonas sp), de la cryptosporidiose (Cryptosporidium sp), des amibes (Entamoeba sp), des microsporidioses (Encephalitozoon sp). Bien entendu, dans tous les cas, il s'agit de techniques « maison », aucun kit n'étant disponible [24, 51] .

La biologie moléculaire d'urgence en infectiologie À ce jour, dans un laboratoire de biologie moléculaire, en conditions optimisées, un résultat peut être rendu en trois à quatre heures (depuis la préparation de l'échantillon jusqu'au résultat final). La biologie moléculaire d'urgence est encore en phase de développement. En dehors du cas particulier du bioterrorisme, elle est moins étudiée. L'apport de la PCR en temps réel et le développement d'automates d'extraction ont permis d'accélérer les étapes de préparation puis d'amplification et de détection des acides nucléiques. Les thermocycleurs disponibles sur le marché (www.biocompare.com) sont de plus en plus rapides. Certaines machines permettent d'obtenir des résultats en cinq minutes, le record actuel étant l'amplification d'un fragment de 85 pb en 78 secondes (30 cycles d'amplification). Un fragment de 2331 pb a pu être amplifié en deux minutes par PCR en temps réel [18] . Des auteurs ont déjà rapporté leur expérience sur ce sujet avec des résultats obtenus en moins de deux heures, traitement de l'échantillon inclus [74] . Outre la PCR en temps réel qui permet d'obtenir un résultat rapidement, d'autres techniques de biologie moléculaire sont en développement [18] . Parmi les autres techniques rapides, on peut citer un certain nombre de techniques d'amplification isotherme qui présentent l'avantage de ne pas nécessiter d'appareils coûteux et d'être rapides comme l'amplification par ramification (RAM, ramification amplification), l'amplification par cercles roulants (RCA, rolling circle amplification), l'amplification par déplacement de brin, la SDA (strand displacement amplification), l'amplification dépendante de l'hélicase, la HDA (helicase-dependent amplification). Des systèmes de détection de plus en plus rapides et à haut débit sont aussi développés. Avec les progrès de l'automatisation et des nanotechnologies, la biologie d'urgence peut devenir rapidement une réalité. Des techniques sans amplification de la cible sont aussi en développement. Il s'agit en général de techniques d'amplification de signal très puissantes. Par exemple, l'hybridation de sondes marquées à l'aide de fluorophores puissants et couplées à des systèmes de détection laser ultrasensibles permet la détection spécifique de bactéries [5, 46] . Ces systèmes (et d'autres) sans amplification de cibles sont rapides (30-40 mn) et utilisent des machines compactes et légères. On peut ainsi penser que dans un avenir proche, la détection ultrarapide d'agents pathogènes y compris sur un terrain éloigné sera possible [18] . En dehors du contexte de bioterrorisme déjà évoqué, la biologie moléculaire appliquée à la recherche d'agents pathogènes en urgence en milieu hospitalier sera une réalité probablement dans quelques années.

Comme exemple d'indications, on peut penser aux cas suivants : 

Face à l'infection de quelque nature qu'elle soit, chaque individu tout en ayant un mécanisme commun de défense, présente des variabilités génétiques non pathologiques (les polymorphismes) pouvant dans certains cas les rendre soit plus susceptibles (plus « fragiles ») soit plus résistants à certaines agressions microbiennes. On parle de facteurs génétiques liés à l'hôte. Les gènes impliqués sont essentiellement des gènes impliqués dans la réponse inflammatoire, la reconnaissance de l'agent infectieux et dans la coagulation [11, 26, 37] . L'hypothèse de facteurs génétiques impliqués dans la résistance ou non à des infections est partie de plusieurs observations cliniques telles par exemple que la résistance au paludisme grave des sujets atteints de drépanocytose. Des études sur jumeaux ont pu aussi démontrer le lien entre la génétique et la susceptibilité potentielle aux infections. La plupart des polymorphismes retrouvés impliqués dans la susceptibilité ou la résistance aux infections présentent des effets de sensibilité ou de protection mineurs. En fait, la réponse globale de sensibilité-résistance aux infections correspond à des effets additonnels/ soustractifs/synergiques/d'interactions entre de multiples facteurs. Il s'agit de la résultante d'interactions complexes que seuls, quelques polymorphismes ne peuvent expliquer [38] . La réponse à l'infection, quel que soit son sens, est trop complexe pour ne se résumer qu'à quelques variants alléliques. L'étude des facteurs génétiques impliqués dans la résistance ou la sensibilité aux infections n'en est donc qu'à ses débuts (domaine de la recherche) et ne présente pas d'intérêt pour le clinicien à ce jour. Il est probable cependant que prochainement, la recherche de plusieurs polymorphismes présents dans un ou plusieurs gènes soit effectuée en parallèle de la mise en évidence de l'agent infectieux causal. Cette carte polymorphique pourra alors par exemple établir un profil de résistance ou de sensibilité à tel ou tel agent infectieux permettant ainsi d'adapter la prévention (vaccination par exemple) ou d'établir le meilleur traitement (domaine de la pharmacogénétique). Le Tableau 5 donne de manière simplifiée quelques exemples.

L'évolution de la biologie moléculaire Chimiokine, ligand de CCR5 Nombre de duplications segmentaires variables (nombre de copies du gène variable) Un nombre bas de copies est associé à une évolution de la maladie plus rapide détection des acides nucléiques, de véritables platesformes permettant d'analyser plusieurs échantillons en parallèle sont à l'étude. Ces appareils sont réservés aux grandes séries. Néanmoins, dans le contexte d'épidémies, on peut imaginer que celles-ci pourraient être utiles dans un contexte d'urgence. Certaines machines permettent ainsi l'analyse de 384 échantillons en parallèle par PCR en temps réel et donnent un résultat en 35 minutes [55] . D'autres systèmes permettent l'analyse par PCR multiplex. D'autres systèmes miniaturisés permettent l'analyse de 1536 échantillons (20 nl à 10 μl distribués par un robot en moins de deux minutes). Bien que ces systèmes n'aient pas encore été utilisés pour les recherches d'agents pathogènes, on peut s'attendre à un développement proche [18] . Par ailleurs, le développement de la portabilité des thermocycleurs laissent penser que la biologie moléculaire sera réalisable non seulement en milieu hospitalier ou en laboratoire privé mais aussi en milieu éloigné comme par exemple, la brousse.

La miniaturisation des automates progresse grâce aux nanotechnologies [18] . La littérature décrit régulièrement de véritables laboratoires sur puces (« lab-on-a-chip ») non commercialisés pour le moment. Par exemple, l'utilisation de particules d'or ou de nanopores dans l'approche diagnostique a été décrite [28, 48] .

La limite de détection À ce jour, on a pu démontrer qu'il était possible de détecter 5-10 pg d'ADN, ce qui représente le contenu d'une seule cellule et 2 pg d'ARN équivalent au contenu en ARNm de 20 cellules. Certains auteurs ont pu détecter des concentrations zeptomolaires d'ADN (10 −21 mole) [58] . La limite de détection s'abaisse donc considérablement et la possibilité de détecter moins de 1 ng d'ADN sera probablement une réalité dans un avenir proche [18] .

En 2007, la biologie moléculaire en pratique quotidienne de microbiologie générale présente un intérêt restreint à certaines indications, les autres indications étant réservées aux laboratoires spécialisés (hôpitaux universitaires ou centres de recherche) (Fig. 3a et b) . Ces derniers jouent un rôle primordial plus particulièrement et idéalement dans Tableau 6 Exemples de sociétés impliquées dans la commercialisation de systèmes de biologie moléculaire pour l'infectiologie (par ordre alphabétique) -Non exhaustif le cadre de réseaux en association avec les organismes internationaux (OMS avec par exemple, les réseaux GOARN, global outbreak alert and response network, GPHIN, global public health intelligence network) afin de surveiller, détecter, isoler, diagnostiquer et prévenir l'apparition de nouveaux agents pathogènes dans le cadre des maladies émergentes (virus du SRAS par exemple) [29] . La Fig. 4 résume les principales indications en microbiologie générale, l'étude du virus de l'hépatite C et la recherche des chlamydiaes représentant les indications les plus courantes et les plus utiles dans les laboratoires de microbiologie générale.

Autorité de santé. Conférence de consensus sur le traitement de l'hépatite C (www.anaes.fr). Février

Évaluation du dépistage des infections urogénitales basses à Chlamydia trachomatis en France. Rapport

Place des techniques de biologie moléculaire dans l'identification des infections urogénitales basses à Chlamydia trachomatis. Rapport

Évaluation de l'intérêt de la recherche des papillomavirus humains (HPV) dans le dépistage des lésions précancéreuses et cancéreuses du col de l'utérus

Price AA generic sandwichtype biosensor with nanomolar detection limits

The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer

Towards a molecular diagnosis of invasive aspergillosis and disseminated candidosis

Towards a nucleic acid-based diagnosis in clinical parasitology and mycology

HPV testing in cervical screening

Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infections -2002

Twin studies demonstrate a host cell genetic effect on productive human immunodeficiency virus infection of human monocytes and macrophages in vitro

Le point sur la tuberculose

Clinical evaluation of the polymerase chain reaction for the rapid diagnosis of tuberculosis

Molecular diagnostics in tuberculosis

IARC HPV Prevalence Surveys Study Group. Worldwide distribution of human papillomavirus types in cytologically normal women in the International Agency for Research on Cancer HPV prevalence surveys: a pooled analysis

Systematic review: noninvasive testing for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae

A-t-on besoin de la biologie moléculaire en mycologie hospitalière ?

Present and future of rapid and/or high-throughput methods for nucleic acid testing

Overview of the European and North American studies on HPV testing in primary cervical cancer screening

Persistence and load of high-risk HPV are predictors for development of high-grade cervical lesions: a longitudinal French cohort study

La prise en charge thérapeutique des personnes infectées par le VIH

Confirmation by 16S rRNA PCR of the COBAS AMPLICOR CT/NG test for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae infection in a low-prevalence population

Nucleic acid testing for viral burden and viral genotyping

Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing

Increased sensitivity of Mycobacterium tuberculosis Cobas Amplicor PCR following brief incubation of tissue samples on Lowenstein-Jensen substrate

Susceptibilité mendélienne aux infections mycobactériennes: défauts de l'axe IL-12/IFNγ

Performance assessment of eight high-throughput PCR assays for viral load quantitation of oncogenic HPV types

Detecting single stranded DNA with a solid state nanopore

Emergent pathogens, international surveillance and international health regulations

Detection and identification of Mycobacterium species isolates by DNA microarray

Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and simultaneous confirmation by automated nucleic acid extraction and real-time PCR

Chlamydia trachomatis urogenital infections in women. Best diagnostic approaches

Epidemiology of sexually transmitted infections in France

Point-of-care molecular diagnostic systems -past, present and future

Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis

Surveillance du VIH/sida en France

Polymorphismes génétiques et infections

Infectogenomics: insights from the host genome into infectious diseases

Congenital cytomegalovirus infection: recent advances in the diagnosis of maternal infection

Identification of medically important yeast species by sequence analysis of the internal transcribed spacer regions

Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare

Intra-assay performance characteristics of five assays for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma

Viral load of human papillomavirus and risk of CIN3 or cervical cancer

Prophylactic human papillomavirus vaccines

Novel sample preparation method for safe and rapid detection of Bacillus anthracis spores in environmental powders and nasal swabs

Applications of single-molecule detection to the analysis of pathogenic DNA

Techniques diagnostiques de la tuberculose et des autres mycobactérioses

Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide molecules

Rapid and specific detection of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast bacillus smear-positive respiratory specimens and BacT/ALERT MP culture bottles by using fluorogenic probes and real-time PCR

Prevalence of chlamydial and gonococcal infections among young adults in the United States

Emerging technologies for the detection and genetic characterization of protozoan parasites

Nucleic acid amplification-based techniques for pathogen detection and identification

Évaluation de l'intérêt de la recherche des papillomavirus humains (HPV) dans le dépistage des lésions précancéreuses et cancéreuses du col de l'utérus

Rapid diagnostic tests for malaria parasites

PCR: replicating success

International Agency for Research on Cancer Multicenter Cervical Cancer Study Group. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer

Advances in the diagnosis and treatment of tuberculosis

Bio-bar-code-based DNA detection with PCR-like sensitivity

Clinical comparison of an enhanced-sensitivity branched-DNA assay and reverse transcription-PCR for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma

Diagnostic tests for chlamydial and gonorrheal infections

Diagnostic accuracy of nucleic acid amplification tests for tuberculous meningitis: a systematic review and metaanalysis

Diagnosis and treatment of chronic hepatitis C infection

Advances and challenges in management of invasive mycoses

Histoire naturelle de l'infection par le virus de l'hépatite B

Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNA gene subunit-based and species-specific real-time PCR assays

Comparison of the QUANTIPLEX HIV-1 RNA 2.0 assay with the AMPLICOR HIV-1 MONITOR 1.0 assay for quantitation of levels of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma of patients receiving stavudine-didanosine combination therapy

Detection and enumeration of airborne biocontaminants

Human papillomavirus biology and cervical neoplasia: implications for diagnostic criteria and testing

Recent trends in molecular diagnostics for Toxoplasma gondii infections

Detection and monitoring of virus infections by real-time PCR

Comparison of non-culturebased methods for detection of systemic fungal infections, with an emphasis on invasive Candida infections

Molecular detection of antibiotic resistance: when and where?

Quantitative PCR assay using sputum samples for rapid diagnosis of pneumococcal pneumonia in adult emergency department patients

Monitoring the therapy of pulmonary tuberculosis by nested polymerase chain reaction assay

Epidémiologie de l'hépatite chronique B

Nouveaux tests virologiques et leurs applications dans la prise en charge de l'hépatite B chronique