key: cord-0915794-y2x2lt08 authors: Becker, Tobias; Kielkowski, Pavel title: Protein-AMPylierungs-Identifikation in lebenden Zellen date: 2020-11-25 journal: Biospektrum (Heidelb) DOI: 10.1007/s12268-020-1491-2 sha: b04be2146cf4127ccb1d2f5a558c9d6775c4b64e doc_id: 915794 cord_uid: y2x2lt08 Protein AMPylation is a prevalent protein post-translational modification in human cells involved in endoplasmic reticulum stress regulation and neural development. In this article we describe the design, synthesis and application of a pronucleotide probe suitable for in situ fluorescence imaging and chemical protemics profiling of AMPylated proteins. Our probe utilizes straightforward strain-promoted azidealkyne click reaction for fluorescence labeling in living cells. transportieren, wie Sofosbuvir gegen Hepatitis C oder Remdesivir, dessen Wirksamkeit gegen das neuartige Coronavirus derzeit getestet wird [5] . Eine weitere Besonderheit der aktivierten N6pATP-Sonde ist ihre Alkingruppe, die sowohl eine Kopplung mit einem Affi nitätstag als auch einem Fluoreszenzfarbstoff zulässt. Hierfür wird die "Click-Chemie" verwendet, die schnell und bioorthogonal ist. Für diese Reaktion wird jedoch Kupfer(I) benötigt, das zytotoxisch ist und damit verhindert, dass AMPylierte Proteine auch in lebenden Zellen fl uoreszenzmarkiert werden können. Um die Fluoreszenzmarkierung AMPylierter Proteine dennoch zu ermöglichen, entwickelte unsere Forschungsgruppe eine weitere Sonde (pro-N6azA), die anstelle eines Alkins ein Azid enthält (Abb.1C, [6] ). Somit kann statt der bisher verwendeten kupferbasierten und zytotoxischen Click-Chemie entweder die kupferfreie strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) oder die Staudinger-Ligation verwendet werden [7] . Protein AMPylation is a prevalent protein post-translational modifi cation in human cells involved in endoplasmic reticulum stress regulation and neural development. In this article we describe the design, synthesis and application of a pronucleotide probe suitable for in situ fl uorescence imaging and chemical protemics profi ling of AMPylated proteins. Our probe utilizes straightforward strain-promoted azidealkyne click reaction for fl uorescence labeling in living cells. DOI: 10.1007/s12268-020-1491-2 © Die Autoren 2020 ó Das menschliche Proteom ist um ein Vielfaches komplexer als das menschliche Genom. Ein Grund hierfür ist, dass Proteine mit bestimmten funktionellen Gruppen modifi ziert werden, um ihre Aktivität, Lokalisierung und Interaktion mit anderen Proteinen zu regulieren [1] . Es gibt unterschiedlichste dieser posttranslationalen Modifi kationen und eine Vielzahl von ihnen ist bereits gut erforscht. In diesem Artikel fokussieren wir uns auf eine posttranslationale Modifi kation, der in jüngster Zeit immer größere Aufmerksamkeit zuteil wird: die AMPylierung [2, 3] . Charakteristisch für diese ist die Übertragung eines Adenosinmonophosphats (AMP) auf eine alkoholische Aminosäureseitenkette, wie Serin, Threonin oder Tyrosin. Diese Reaktion wird von AMP-Transferasen (AMPylatoren) katalysiert, die Adenosintriphosphat (ATP) als Ko-Substrat verwenden (Abb. 1A). Zur genaueren Untersuchung der AMPylierung wurden bereits unterschiedliche Methoden eingesetzt, wie etwa strukturell veränderte ATP-Analoga in Zelllysaten. Dies hat allerdings einen großen Nachteil: Die ATP-Analoga weisen aufgrund von Phosphatresten negative Ladungen auf, wodurch sie die Zellmembran nicht passieren können. Die Analyse der AMPylierung mit ATP-Analoga in lebenden Zellen ist aus diesem Grund nicht möglich. Um diese Problematik zu umgehen, entwickelte unsere Forschungsgruppe eine zellpermeable Sonde (pro-N6pA), die anstelle eines Triphosphats eine Phosphoramidatgruppe enthält (Abb. 1B, [4] Damit war die Voraussetzung für die anschließenden chemischen Proteomik-Experimente geschaffen [8] , durch die die Zielproteine der pro-N6azA-Sonde genauer identifi ziert werden sollten (Abb. 2B). Hierfür wurden intakte HeLa-Zellen über einen Zeitraum von 16 Stunden mit einer Konzentration von 100 Mikromol der pro-N6azA-Sonde behandelt, was -wie oben beschrieben -bewirkt, dass die AMPylierten Zielproteine einen zusätzlichen Azidrest tragen. Im Anschluss wurden die modifi zierten Proteine mittels Staudinger-Ligation an einen Biotin-Affi nitätstag gekoppelt, der eine darauffolgende Affinitätsanreicherung an Avidin-Nachdem die geeignete Konzentration der pro-N6azA-Sonde festgelegt war, konnte im nächsten Schritt untersucht werden, ob die Sonde von endogenen AMPylatoren akzeptiert wird. Der hierzu verwendete Ansatz basiert darauf, dass AMPylierte Zielproteine bei erfolgreicher Aktivierung der Sonde einen zusätzlichen Azidrest aufweisen, der mittels SPAAC an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden kann. In der Folge kann dieser mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und einer geeigneten Kamera mit Fluoreszenzfi lter detektiert werden. Die SDS-PAGE-Analyse zeigt, dass die pro-N6azA-Sonde erfolgreich von endogenen AMPylatoren als Substrat verwendet wurde, da ohne Einsatz der Sonde keine Fluores-Da die neu synthetisierte Sonde pro-N6azA in lebenden Zellen verwendet wird, musste zunächst Ihre Zytotoxizität mittels MTT-Test bestimmt werden. In HeLa-Zellen (humane Krebszelllinie) wurde hierbei ein IC 50 von 239,2 Mikromol gemessen, was bedeutet, dass bei dieser Konzentration der Sonde 50 Prozent der Zellen sterben. Deswegen entschieden wir uns dafür, die darauffolgenden Experimente mit einer Konzentration von 100 Mikromol durchzuführen, um eine möglichst hohe Sondenkonzentration bei ausbleibender Zytotoxizität sicherzustellen. Eine hohe Sondenkonzentration ist notwendig, damit N6azATP mit dem natürlich in der Zelle vorkommenden ATP konkurrieren kann. Identifi zierung von AMPylierungs-Zielen durch chemische Proteomik-Experimente. A, Fluoreszenzscan von SDS-PAGE-getrennten Proteinen, die mit der pro-N6azA-Sonde in lebenden Zellen behandelt wurden und mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden. B, schematische Darstellung der chemischen Proteomik-Methode. HeLa-Zellen wurden zunächst über einen Zeitraum von 16 Stunden mit 100 μM der pro-N6azA-Sonde behandelt. Im Anschluss wurden die modifi zierten Proteine entweder an einen Biotin-Affi nitätstag oder einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Der Fluoreszenzfarbstoff wurde dabei zur Visualisierung der AMPylierten Proteine verwendet, wobei der Biotin-Affi nitätstag zur Anreicherung und anschließenden Analyse mittels Massenspektrometrie diente. C, volcano plot mit pro-N6azA-angereicherten Proteinen. Proteine, die zuvor mit der pro-N6pA-Sonde identifi ziert wurden, sind grün hervorgehoben. Proteine, die zusätzlich mit der pro-N6azA-Sonde identifi ziert wurden, sind rot hervorgehoben. A B C Agarose beads erlaubt. Die so angereicherten Proteine wurden durch das Verdauungsenzym Trypsin zu kleineren Peptidfragmenten abgebaut und konnten schließlich mittels einer Kombination aus einem Massenspek trometer und Flüssigkeitschromatographie analysiert werden. Zur Erfassung der AMPylierungs-Ziele wurde die label-free quantifi cation (LFQ) eingesetzt [9] , die auch immer Kontrollexperimente für einen Vergleich der veränderten AMPylierungs-Niveaus benötigt. Hierzu wurden HeLa-Zellen mit Dimethylsulfoxid (DMSO), dem Lösemittel der pro-N6azA-Sonde, behandelt, um auszuschließen, dass unspezifisch angereicherte Proteine fälschlicherweise als AMPylierungs-Ziele kategorisiert werden. Die Ergebnisse zur Identifi zierung der Zielproteine der pro-N6azA-Sonde sind in einem volcano plot dargestellt, der sich dadurch auszeichnet, dass er sowohl die Signifi kanz als auch die Stärke der Anreicherung visualisiert. Das heißt, je signifikanter und stärker ein Protein angereichert wurde, desto weiter rechts und oben ist dieses im volcano plot zu sehen. In unseren Experimenten wurde deutlich, dass sowohl bereits bekannte (grün markiert) als auch bisher unidentifi zierte (rot markiert) AMPylierungs-Ziele bei Verwendung der pro-N6azA-Sonde signifikant angereichert wurden (Abb. 2C). Somit konnten wir belegen, dass sich die pro-N6azA-Sonde zur Identifi zierung von AMPylierungs-Zielen in lebenden Zellen eignet. Damit wurde die Grundlage zur Visualisierung der AMPylierung mittels Fluoreszenzmikroskopie in lebenden Zellen geschaffen, welche bisher noch nicht möglich war. Die Visualisierung würde es ermöglichen, die Dynamik der AMPylierung in lebenden Zellen zu überwachen und so dazu beitragen, die Funktion dieser posttranslationalen Modifi kation in zellulären Schlüsselprozessen aufzuklären. Zur Etablierung der neuen Methode wurde die Detektion der Fluoreszenzmarkierung mittels Fluoreszenzmikroskopie zunächst durch Kontrollexperimente in fi xierten Zellen überprüft. Hierzu wurden im ersten Schritt HeLa-Zellen über einen Zeitraum von 16 Stunden mit der pro-N6azA-Sonde behandelt und anschließend fi xiert. Im Anschluss wurden die fi xierten Zellen mithilfe von Click-Chemie an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt und unter einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert. Dabei zeigte sich einerseits, dass die Fluoreszenzmarkierung mittels Fluoreszenzmikroskopie gut sichtbar ist, und andererseits, dass der Großteil der Modifi kation im Zellkern lokalisiert ist (Abb. 3A). Dieser Rückschluss ist zulässig, da die Fluo res zenzmarkierung mit dem Fluo res zenz farbstoff DAPI kolokalisiert, der sich an DNA anlagert (Abb. 3A). Ein kleiner Teil der AMPylierten Proteine fi ndet sich auch im Cytoplasma, was wiederum gut mit vorherigen Studien an der pro-N6pA-Sonde übereinstimmt. Nachdem wir in den Kontrollexperimenten erfolgreich demonstrieren konnten, dass die Fluoreszenzmarkierung durch pro-N6azA in fi xierten Zellen funktioniert, sollte im nächsten Schritt untersucht werden, ob dies auch in lebenden Zellen möglich ist. Dazu wurden sowohl HeLa-Zellen als auch Fibroblasten 16 Stunden lang mit der pro-N6azA-Sonde behandelt und im Anschluss ohne Fixierung direkt in lebenden Zellen mittels SPAAC an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Hierbei ist nochmals hervorzuheben, dass SPAAC im Gegensatz zur klassischen Click-Chemie kein toxisches Kupfer(I) zur Katalyse benötigt und damit in lebenden Zellen verwendet werden kann. Nach der Kupplungsreaktion wurden die Zellen für weitere 24 Stunden inkubiert und anschließend mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Dabei wurde erkennbar, dass beide Zelllinien erfolgreich fl uoreszenzmarkiert wurden. Dies beweist auf der einen Seite, dass die pro-N6azA-Sonde in der Lage ist, die AMPylierung in lebenden Zellen zu visualisieren und auf der anderen Seite, dass die AMPylierung eine stabile posttranslationale Modifi kation ist (Abb. 3B). Zudem fällt auf, dass die AMPylierten Proteine in Fibroblasten im Gegensatz zu HeLa-Zellen hauptsächlich im Cytoplasma vorliegen. Damit war bewiesen, dass sich die pro-N6azA-Sonde zur Fluoreszenzmarkierung AMPylierter Proteine in lebenden Zellen eignet und wir konnten uns im Folgenden auf das fi nale Ziel unsere Studie konzentrieren -nämlich die Dynamik der AMPylierung in angemessener räumlicher und zeitlicher Auflösung zu visualisieren. Hierzu wurden Fibroblasten mit der pro-N6azA-Sonde behandelt und über einen Zeitraum von 25 Minuten alle 20 Sekunden Momentaufnahmen mit einem konfo-kalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen (Abb. 3C). Dabei zeigte sich, dass sich die Lokalisierung der AMPylierten Proteine über die Zeit veränderte und diese gerichtet vom Zentrum der Zelle an die Enden der Zellkörper transportiert wurden. Diese Beobachtung lässt zum einen darauf schließen, dass die AMPylierung möglicherweise eine Rolle bei der Zellpolarisierung spielt und zum anderen, dass die pro-N6azA-Sonde geeignet ist, die Dynamik der AMPylierung in lebenden Zellen nachzuverfolgen. Damit eröffnen sich für die Zukunft viele neue Möglichkeiten zur besseren Charakterisierung dieser weitgehend uncharakterisierten posttranslationalen Modifi kation. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass es uns gelungen ist, mit der pro-N6azA-Sonde ein leistungsfähiges chemisch-biologisches Werkzeug für zukünftige Studien zur Unter-suchung der Protein-AMPylierung zu etablieren. Hierbei ist insbesondere hervorzuheben, dass die Sonde es ermöglicht, die Dynamik der Protein-AMPylierung in lebenden Zellen unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop zu verfolgen. ó How many human proteoforms are there? Enzymes involved in AMPylation and deAMPylation From young to old: AMPylation hits the brain 2020) FICD activity and AMPylation remodelling modulate human neurogenesis The ProTide prodrug technology: from the concept to the clinic A pronucleotide probe for live cell imaging of protein AMPylation A strain-promoted [3 + 2] azide alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems Activity-based protein profi ling in vivo using a copper(I)-catalyzed azidealkyne [3 + 2] cycloaddition Accurate proteome-wide label-free quantifi cation by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ