key: cord-0845795-cq7eiigs authors: Rua, Katherine Palacio; Correa, Juan Felipe García; Aguilar, Wbeimar; Ayala, Carlos Afanador; Rugeles, María Teresa; Zuluaga, Andres F title: Validación De Una Técnica De Pcr Duplex Usando El Gen E Y Rnasa P Para El Diagnóstico De Sars-Cov-2 date: 2021-01-19 journal: Enferm Infecc Microbiol Clin DOI: 10.1016/j.eimc.2020.12.014 sha: a0f9a9f8456646dd9716bcd25078f2d73b526fa5 doc_id: 845795 cord_uid: cq7eiigs Introduction: Reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT-PCR) is the standard technique for SARS-CoV-2 diagnosis. The World Health Organization recommends the Charité-Berlin protocol for COVID-19 diagnosis, which requires triple PCR, limiting the process capability of laboratories and delaying the results. In order to reduce these limitations, a duplex PCR is validated for the detection of the E and ribonuclease P genes. Methods: We compared the limit of detection, sensitivity and specificity of the duplex PCR technique (E gene and Rnasa P) against the monoplex standard (E gene) in RNA samples from a SARS-CoV-2 isolate and 88 clinical specimens with previously known results. The repeatability and reproducibility of the threshold cycle values (Ct) were determined in two independent laboratories of the Faculty of Medicine of the Universidad de Antioquia, using different reagents and real time instruments. Results: There were no significant differences in the Ct results between both techniques (p = 0.84). Using the monoplex PCR of E gene as a reference, the interrater reliability analysis showed similarity between the two techniques, with a kappa coefficient of 0.89, the sensitivity and the specificity of duplex PCR were 90% and 87%, respectively. Conclusions: Duplex PCR does not affect the sensitivity and specificity reported by the Charité, Berlin protocol, being a useful tool for SARS-CoV-2 screening in clinical samples. A finales de diciembre del 2019, la ciudad de Wuhan, provincia de Hubei, China, se generó una alerta por el diagnóstico de pacientes con síntomas de neumonía de origen desconocido en diferentes entidades hospitalarias, los cuales estaban epidemiológicamente relacionados con frecuentar y consumir comida de un mercado mayorista de mariscos (1) . Para finales de 2019 e inicios de 2020, el Centro de Control y prevención de enfermedades de China (China CDC) identificó la causa de la enfermedad como un nuevo coronavirus que fue nombrado por el Comité Internacional de Taxonomía de los Virus en febrero del 2020 como SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) y desde el 11 de febrero de 2020 la enfermedad fue llamada COVID-19 (Coronavirus disease 2019) (2) . En la actualidad se encuentran publicadas cerca de 40.000 secuencias del SARS-CoV-2 en la base de datos de GenBank (hasta 10 de noviembre de 2020), incluyendo la secuencia genómica completa de este nuevo agente, lo que ha permitido el desarrollo de diferentes protocolos diagnósticos, entre ellos la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real con sondas y cebadores de conocimiento general, para la detección de SARS-CoV-2. El 17 de enero de 2020, la OMS (Organización Mundial de la Salud) publicó una actualización de los protocolos aprobados para realizar pruebas de laboratorio (3) y el 01 de febrero del mismo año, la PAHO (Organización Panamericana de Salud) adoptó el protocolo desarrollado por el Hospital Charité, Berlín, Alemania, como el método de diagnóstico utilizado para la detección de SARS-CoV-2 (4), directriz que fue acogida por el Instituto Nacional de Salud de Colombia. El protocolo Charité, Berlín, Alemania, realiza el diagnóstico de SARS-CoV-2 mediante la amplificación y detección de una región de la envoltura viral (gen E), compartida por diferentes betacoronavirus del subgénero Sabercovirus como prueba de cribado y en aquellas muestras detectadas como positivas se debe realizar una PCR confirmatoria que detecta una región específica de SARS-CoV-2 ubicada en el gen RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) (5) . Además, siguiendo las buenas prácticas de laboratorio, debe incluirse la amplificación de un gen control humano, que identifique la viabilidad de la muestra, inhibidores de PCR y evalúe la eficiencia de extracción de ARN; el gen más usado para este fin es el de la ribonucleasa P (RNasa P). De acuerdo con lo anterior, para realizar el diagnóstico de SARS-CoV-2 se deben realizar 3 PCR independientes, lo que retrasa el tiempo de diagnóstico, disminuye la oportunidad de entrega de los resultados y genera un mayor consumo de reactivos, aumentando los costos de la prueba. Debido a la alta demanda de reactivos en el mundo; a que las importaciones de estos elementos demoran más de 30 días en Colombia; sumado al aumento de nuevos casos en las últimas semanas, es necesario realizar un uso racional de las pruebas y desarrollar metodologías que permitan optimizar los recursos disponibles. La implementación de una PCR dúplex entre los genes E y RNasa P podría disminuir el tiempo para obtener resultados de las pruebas y aumentar la capacidad de procesamiento de los laboratorios. El objetivo de este estudio es validar una técnica de PCR dúplex para el diagnóstico de SARS-CoV-2 basada en la detección del gen E y ribonucleasa P. Cultivo celular de SARS-CoV-2 y especímenes clínicos. Se realizó extracción de ARN a partir de la cepa del SARS-CoV-2 aislado y cultivado en el grupo Inmunovirología de la Universidad de Antioquia (6), el cual sirvió como control positivo para estandarizar y evaluar el funcionamiento de la PCR dúplex. Se seleccionaron 88 muestras de ARN de especímenes clínicos procedentes de muestras de aspirado e hisopado nasofaríngeo de pacientes con sospecha de COVID-19, las cuales tenían resultado previo para SARS-CoV-2. Se realizó la PCR dúplex para las muestras en el Laboratorio Integrado de Medicina Especializada (LIME) y en el Grupo Inmunovirología (IMV), ambos de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia, con el objetivo de evaluar la repetibilidad y reproducibilidad de la técnica usando reactivos y equipos diferentes. Extracción de ARN. Para el aislado viral, se realizó la extracción a partir de sobrenadantes de cultivo usando el sistema automatizado de extracción SaMag-12 y el estuche comercial SaMag™ Viral Nucleic Acid Extraction Kit (Sacace biotechnologies, Italia), siguiendo las instrucciones de la casa comercial, con un volumen de elución de 30 µL. La extracción de ARN de especímenes clínicos se realizó a partir de muestras de aspirado nasofaríngeo o hisopado nasofaríngeo de pacientes con sospecha de COVID-19, utilizando dos sistemas automatizados con tecnología de magnetos para la extracción de ARN Magmax (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) y SaMag™ (Sacace biotechnologies, Italia) en LIME e IMV, respectivamente; además, se realizaron extracciones manuales con el Quick-RNA Viral Kit (ZYMO RESEARCH), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El volumen de elución para los kits automatizados fue de 30-50 µL y para el kit manual de 15 µL. Es de aclarar que se realizó extracción por diferentes metodologías con el objetivo de ampliar la capacidad diagnóstica del laboratorio y de acuerdo con la disponibilidad de reactivos en Colombia. El ARN se almacenó a -80°C hasta su uso y se utilizó el mismo producto extraído de cada muestra para todas las reacciones de RT-PCR que se analizarán en este artículo. RNasa P fue empleado como control interno de reacción y se amplificó utilizando dos pares de oligonucleotidos cebadores: 68 muestras se amplificaron con los oligonucleótidos y sonda publicados por la CDC para detección de SARS-CoV-2 (7) y 20 muestras fueron amplificadas usando la sonda de CDC, pero con un par de cebadores diseñados en la unión exones 1 y 2 del gen RNasa P (RNasa-P-Fw: 3'-ATGGCGGTGTTTGCAGATTTG-5' y RNasa-P-Rv: 3'-CAACTGAATAGCCAAGGTGAGC-5') para asegurar la amplificación del ARN extraído, excluyendo el ADN genómico. Las sondas E y RdRp se marcaron con el fluoróforo FAM y para RNasa P se utilizó VIC o HEX, de acuerdo con la compatibilidad de los equipos de PCR en tiempo real utilizados. Ensayos de qRT-PCR para la detección de SARS-CoV-2. Se realizó la retrotranscripción y posterior amplificación del genoma viral de SARS-CoV-2 en tiempo real (qRT-PCR) utilizando la enzima SuperScript™ III One-Step RT-PCR System (Invitrogen™) y la Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (New England Biolabs). El gen E se amplificó de manera individual (monoplex) y en dúplex con RNasa P; el gen RdRp solo se amplificó en monoplex. Las amplificaciones por PCR para los genes virales RdRp y E (tanto en monoplex como dúplex) se realizaron siguiendo las recomendaciones de concentraciones de oligonucleótidos (cebadores y sondas) publicadas en el protocolo Charité, Berlín (5), la RNasa P se amplificó en la PCR dúplex con una concentración de oligos de 0,15 µM y sonda a 0,2 µM. Las condiciones de termociclaje para la enzima SuperScript™ III One-Step RT-PCR System (Invitrogen) fueron las publicadas en el protocolo Charité, Berlín (5) y cuando se usó la enzima Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (New England Biolabs), se modificó la retrotranscripción a 55°C por 18 minutos y el alineamiento/extensión a 60°C por 30 segundos, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las muestras fueron consideradas positivas cuando la fluorescencia sobrepasa umbral de detección en un Ct menor a 38 y aumenta gradualmente a lo largo de los ciclos generando una curva de amplificación sigmoidal. Las muestras con Ct mayor a 38 fueron consideradas negativas. Para la comparación del desempeño entre el ensayo dúplex y el monoplex, se utilizó ARN extraído a partir de la cepa SARS-CoV-2 aislada en el Grupo Inmunovirología. Se realizaron diluciones decimales seriadas del ARN viral utilizando como diluyente ARN extraído a partir de una muestra negativa para SARS-CoV-2, finalizando en la dilución 1x10 -8 . Se realizaron 5 réplicas de las amplificaciones de los genes E y J o u r n a l P r e -p r o o f ref. EIMC-D-20-00418 REVISADO dúplex E más RNasa P: tres de ellas en LIME y dos en el grupo Inmunovirología. Por su parte, la PCR del gen RdRp se realizó por triplicado en LIME. La reproducibilidad de los resultados, entre laboratorios, se evaluó al comparar dos extracciones de ARN del cultivo viral, las cuales se diluyeron de forma independiente desde 1x10 -1 hasta 1x10 -8 ; posteriormente, se realizó PCR por duplicado de los genes E y duplex E más RNasa P en cada serie de dilución. Finalmente, para evaluar el funcionamiento de la PCR dúplex en muestras clínicas, se seleccionaron 88 muestras de ARN de pacientes con sospecha de COVID-19 (39 positivas y 49 negativas para SARS-CoV-2), las cuales fueron analizadas en los termocicladores 7500 Fast (Applied Biosystems) y CFX-96 (Biorad) usados en LIME y IMV, respectivamente. Cálculos estadísticos. Los ciclos umbrales (Ct) de las muestras identificadas como positivos para SARS-CoV-2 de las amplificaciones en monoplex y dúplex fueron comparados utilizando la prueba T pareada en el software Statistics Kingdom (https://www.statskingdom.com). Un valor p<0.05 fue considerado como significativo. Los resultados de SARS-CoV-2 de las muestras clínicas obtenidos en monoplex y dúplex fueron comparados utilizando el coeficiente de concordancia Kappa de Cohen. Un valor kappa entre 0.81 y 1 es considerado como una concordancia "casi perfecta" (8). Los valores de sensibilidad y especificidad se obtuvieron utilizando el software Medcalc (https://www.medcalc.org/). Se realizaron 3 PCRs independientes: gen E y RdRp en monoplex, y E más RNasa P en dúplex, de las diluciones seriadas del ARN viral procedente de cultivo celular utilizando como diluyente ARN extraído a partir de una muestra negativa para SARS-CoV-2. La concentración del cultivo viral al momento de la extracción era de 4.2x10 6 UFP/mL, que de acuerdo con la cuantificación de otros aislados de SARS-CoV-2 (9) corresponde a una concentración aproximada de RNA de 4x10 9 equivalentes genómicos/mL, y fue diluido de forma decimal hasta 1x10 -9 ; posteriormente, se realizaron las 3 PCRs de forma simultánea, con cinco réplicas de cada dilución para el gen E y la dúplex E más RNasa P (3 réplicas realizadas en el laboratorio LIME y 2 réplicas en inmunovirología), mientras que el gen RdRp se amplificó por triplicado en LIME. No hubo diferencias significativas en los resultados de Ct (valor de p = 0,7662) entre la monoplex del gen E y su combinación con RNasa P (Tabla 1), de hecho, los promedios y desviaciones estándar de los Ct fueron similares entre grupos en todas las diluciones y se identificó la detección en las cinco réplicas de la dilución 1x10 -7 , correspondiente a 0.42 equivalentes genómicos/µL. Esto demuestra la repetibilidad y reproducibilidad de los resultados. La dilución 1X10 -8 amplificó en tres de las 5 réplicas, donde se observan los efectos estocásticos producidos por la baja carga viral de las diluciones y la amplificación por debajo del límite de detección reportado por el protocolo Charité, Berlin de 5.2 copias (5). Cabe mencionar que el gen RdRp presenta una menor sensibilidad (dilución 1X10 -7 ) comparada con el gen E (dilución 1X10 -8 ), por lo tanto, para las muestras débiles positivas es recomendable utilizar un gen específico que presente mayor sensibilidad (Tabla 1). La Figura 1 muestra una óptima amplificación del gen E en la PCR dúplex, logrando una sensibilidad indistinguible de la obtenida con la PCR monoplex del gen E al comparar los valores de Ct. El análisis de las curvas de amplificación de las diferentes diluciones evaluadas demuestra la característica sigmoidal en presencia de altas concentraciones de ARN viral; sin embargo, cuando la RNasa P tiene una concentración mucho mayor que el gen E, como sucede en las diluciones iguales o mayores a 1X10 -7 , se observa un aplanamiento de la curva de amplificación del gen E debido al agotamiento de los reactivos en los ciclos finales de la reacción de PCR. Este mismo efecto de aplanamiento de la curva puede observarse para las curvas de la RNasa P en reacciones en las que el gen E tiene alta concentración de ARN, incluso puede ser inhibida su amplificación como se evidencia en la primera serie de dilución de la PCR dúplex en la Tabla 1. Se observan dos curvas de amplificación correspondientes al marcador E en PCR monoplex y en dúplex para las diferentes diluciones del ARN viral proveniente de cultivo. En la Tabla 2 se presenta el ensayo final de reproducibilidad entre laboratorios, para el cual se realizaron dos extracciones del aislado viral con concentración de 4.2X10 6 UFP/mL, obteniendo resultados concordantes en la PCR dúplex E más RNasa P (valor de P = 0,27). 11 23 23 0 24,8 12 26,7 26,4 27,6 28,5 13 23,7 23,8 33,2 25,1 14 19,5 19,4 26,8 21,5 15 0 0 29,1 0 16 0 0 31 0 17 0 0 32,8 0 18 0 0 Los valores de Ct del gen E obtenidos por la PCR monoplex y Duplex (E más RNasa P) no mostraron diferencias significativas en la prueba T pareada (p=0.84). Se observó una concordancia adecuada entre los resultados obtenidos para el gen E tanto en dúplex como monoplex (Figura 2) en especímenes clínicos, demostrando que la técnica dúplex es una buena prueba de cribado, con alta sensibilidad en la detección de muestras positivas, las cuales fueron posteriormente confirmadas con el gen específico RdRp. Comparación de las curvas de amplificación del gen E por la estrategia de PCR monoplex y dúplex. Las curvas del mismo color representan los resultados obtenidos por las dos metodologías. Se presentan como ejemplo, tres pacientes positivos (curvas verde, roja, amarilla) y un paciente negativo (azul). El análisis de concordancia entre los resultados de la PCR monoplex E y Duplex (E más RNAsa P) demostró similitud entre las dos técnicas, con un coeficiente kappa de Cohen de 0.89, el cual permite afirmar que la fuerza de concordancia de ambas técnicas es excelente (8), con un porcentaje de acuerdo de resultados entre los métodos del 89%. Así mismo, se calculó la sensibilidad y especificidad de la PCR dúplex (E más RNAsa P) teniendo como patrón la PCR monoplex E, obteniendo valores de ref. EIMC-D-20-00418 REVISADO sensibilidad del 90% y especificidad del 87%. La divergencia observada entre ambas estrategias se evidenció con muestras con Ct>34, correspondientes a muestras con baja cantidad de virus. La amplificación en PCR dúplex del gen E_Sarbeco publicado en el protocolo Charité, Berlín en conjunto con el gen RNasa P, como se demuestra en este artículo, es una herramienta de gran utilidad para el cribado de SARS-CoV-2 en muestras clínicas porque optimiza el consumo de reactivos, el tiempo en la obtención de resultados, mejora la capacidad instalada necesaria para el diagnóstico y a su vez disminuye el costo de la evaluación. Nuestros resultados demuestran que la PCR dúplex no afecta la sensibilidad y especificidad informadas por el protocolo Charité, Berlín y confirman que muestras con carga viral alta (Ct para el gen E menores a 34), presentan concordancia del 100% entre el gen E y RdRp. En el análisis de las curvas de amplificación de muestras con baja carga viral se evidencia una disminución en la intensidad de fluorescencia de la curva del gen viral específico, siendo más marcado cuando existen altas concentraciones de ARN humano. Lo anterior puede deberse a que existe una menor probabilidad de apareamiento entre secuencias complementarias (primers y sondas) con el ARN viral en concentraciones menores o incluso presencia de inhibidores en las muestras que afecten la eficiencia de la PCR. En el caso puntual de la técnica PCR dúplex, este fenómeno se acentúa por la amplificación temprana del control interno de reacción y aumento de los fragmentos de RNasa P disponibles en la reacción, lo que suponemos, indujo el aplanamiento observado en la curva de amplificación del gen E y modificó la apariencia sigmoidal de la misma, generando amplificaciones lineales, aunque sin modificar los valores de Ct. De hecho, las muestras con baja carga viral (Ct>34), como las muestras 48, 49, 66, 75 informadas en la tabla 3, coinciden con el Ct obtenido del aislado viral a diluciones mayores de 1x10 -8 (4.2X10 -2 UFP/mL) en la tabla 1, donde se observa menor reproducibilidad en los resultados de la PCR de las 5 réplicas, tanto para el gen E en monoplex, como para la PCR dúplex. Es importante resaltar que las muestras con Ct>34 son las que afectan la concordancia entre la PCR monoplex y dúplex, lo cual puede deberse a estar cerca al límite de detección del protocolo Berlín utilizando el primer E_sarbeco, sugiriendo que los resultados discordantes de estas muestras se deben a la sensibilidad del protocolo Berlín y no a la estrategia de PCR dúplex. Contrario a lo informado por el protocolo Charité, Berlín, nuestros resultados muestran una mejor sensibilidad para el marcador E Sarbeco en comparación al RdRp. Esto concuerda con lo informado por otros autores (9-11) y demuestra la necesidad de emplear otro marcador confirmatorio más sensible y estable, que presente una baja tasa de mutaciones que puedan afectar la eficiencia de la PCR. Report of clustering pneumonia of unknown etiology in Wuhan City. Wuhan Municipal Health Commission A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. 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