key: cord-0809178-wnmnxbro authors: Fontaine, O.; Dueluzeau, R.; Raibaud, P.; Chabanet, C.; Popoff, M. R.; Badoual, J.; Gabilan, J. C.; Andremont, A. title: Comparaison entre le nombre et la nature des clostridium fécaux et d'autres facteurs de risque impliqués dans la pathologie intestinale des nouveau-nés date: 1986-07-08 journal: Annales de l'Institut Pasteur / Microbiologie DOI: 10.1016/s0769-2609(86)80094-1 sha: 1a5886561e31151f2ccef5c09c74040c07d24896 doc_id: 809178 cord_uid: wnmnxbro Summary One-hundred and fifteen infants aged 1 to 31 days from two intensivecare units were grouped into 6 classes according to clinical criteria (enterocolitis with or without anatomopathological examination and pneumatosis intestinalis, ≪haemorrhagic colitis ≫, acute diarrhoea or absence of intestinal disorders). The total number of viable bacteria, the number of Clostridium and, in some cases, the presence of rota- and/or coronavirus were determined in their stools. The incidence of Clostridium in the stools of infants with enterocolitis (with or without pneumatosis intestinalis) or haemorrhagic colitis was not significantly different from that of infants without intestinal disorders, whereas stools of infants with acute diarrhoea less often contained Clostridium than those of other infants. C. butyricum, C. difficile, C. perfringens, C. tertium, and C. sordellii were identified. Correspondence analysis comparing the variable, ≪clinical profile≫, with 23 other variables, suggested that the variables of gemellity, a birth-weight below 1900 g, a gestational age of less than 35 weeks, respiratory distress, umbilical catheterization and a Clostridium count above 107/g at the onset of clinical signs, i.e. between 8 to 12 days of age, were linked to the clinical profile of necrotizing enterocolitis with pneumatosis intestinalis. Conversely, the absence of gemellity, a high birthweight and gestational age, the absence of respiratory distress or umbilical catheterization, the onset of diarrhoea within 8 days, and the presence of rota- and/or coronavirus in the stools were linked with a clinical profile of acute diarrhoea. L'ent6rocolite ulc6ron6crosante (ECUN) du nouveau-n6 est l'urgence chirurgicale la plus fr6quente et la plus grave dans les services de p6diatrie n6onatale [11] . Cependant, d'autres troubles digestifs, de moindre gravit6, peuvent aussi survenir : troubles du transit ~t type de subocclusion, rectorragies, diarrh6es aigu~s. Peu d'6tudes ont port6 sur la comparaison des populations de nouveau-n6s atteints de ces diverses maladies. La plupart ont 6t6 consacr6es ~t l'6tiologie de I'ECUN : r61e des bact6ries intestinales, ent&obac-t6ries et Clostridium principalement [1, 22] ; r61e des virus: rotavirus [19] , coronavirus [3] ; r61e des facteurs non microbiens tel que le retentissement sur l'h6modynamique m6sent6rique, de la pathologic de la grossesse, de l'accouchement et de la p6riode postnatale imm6diate (ent6ropathie isch6mique) [7, 25] ; r61e de l'alimentation des nouveau-n6s [6] ; r61e de facteurs immunologiques [8] . Le but du present travail a 6t6 de recueillir des donn6es microbiologiques (nombre et nature des Clostridium f6caux, pr6sence de virus) et des donn6es cliniques chez des nouveau-n6s souffrant, ou non, de troubles digestifs, afin de tenter de d6finir plus pr6cis6ment les facteurs pouvant 6ventuellement constituer un crit+re de risque. Le tableau I indique la r6partition des nouveau-n6s dont les selles ont 6t6 analy-s6es, en fonction des unit6s d'hospitalisation d'origine et du diagnostic clinique for-mul6 au moment du pr616vement de selles. La classe M01 souffrait d'ECUN, confirm6e par examen anatomopathologique. La classe M02 pr6sentait les signes caract6ristiques d'ECUN, notamment la pneumatose radiologique (sans 6tude anatomopathologique). La classe M03 pr6sentait une suspicion d'ECUN, avec notamment, ~t l'examen radiologique, une distension fixe d'anses intestinales pendant au moins 12 h, ECUN = ent6rocolite ulc6ron6crosante. Les chiffres repr6sentent le nombre d'enfants par classe (entre parentheses :nombre de nouveau-n6s retenus pour l'analyse des correspondances). mais sans pneumatose. La classe M04 souffrait de troubles digestifs group6s sous le terme de << colites h6morragiques >> (rectorragies sans diarrh6e ou subocclusion et sans anomalie radiologique abdominale d6celable). La classe M05 pr6sentait une diar-rh6e aigu6. La classe M06 6tait constitu6e de nouveau-n6s hospitalis6s dans les m~mes unit6s pour des affections diverses ~t l'exclusion des troubles digestifs. Cent quinze nouveau-n6s ont 6t6 6tudi6s, dont 20 (4 dans la classe M01, 2 dans la classe M02, 4 dans la classe M03, 4 dans la classe M04, 4 dans la classe M05 et 2 dans la classe M06) avaient 6t6 trait6s par antibiotiques le jour pr6c6dent celui du pr616vement de selles, le plus souvent avec une association de p6nicilline semi-synth6tique (ampicilline) et d'aminoside (gentamicine). Un seul (classe M05) avait 6t6 nourri au sein. La plupart avaient re~u du lait: lait maternel tir6, lait de femme frais ou lyophilis6, lait maternis6. D'autres avaient re~u des substituts de lait ou des r6gimes synth6tiques par voie orale. Treize enfants avaient re~u une alimentation parent6rale (1 dans la classe M01, 4 dans la classe M02, 2 dans la classe M03, 3 dans la classe M04, 3 dans la classe M05). L'~ge des nouveau-n6s lors de l'apparition des premiers signes cliniques, ou lors de l'examen bact6riologique de selles pour la classe M06, est indiqu6 dans le tableau II. Aucune 6pid~mie n'a ~t~ constat6e durant la p~riode d'6tude. TABLEAU II. --Age des nouveau-n~s lors de l'apparition des premiers signes cliniques. Age (jours) M01 M02 M03 M04 M05 M06 1 --5 1 5 0 6 11 3 6 --9 1 0 2 8 6 6 10 --12 4 1 3 9 2 4 13 --19 1 1 1 10 2 7 20 --31 1 3 2 5 3 7 Les chiffres des colonnes MO1/t MO6 indiquent le nombre de nouveau-n6s; en MO6: nouveau-n6s t6moins (sans troubles digestifs). Apr~s leur 6mission, les selles ont 6t6 conserv6es/~ 4°C pendant quelques heures, au plus 24 h, dans la couche du nouveau-n6. Une gamme de dilutions d6cimales a 6t6 pr6par6e, et 1 ml des dilutions ad6quates a 6t6 ensemenc6 en ana6robiose, en tubes de 8 × 400 mm [17] dans les deux milieux non s61ectifs suivants : milieu B' [20] et milieu D [17] . Ces milieux ont 6t6 incub6s /t 37°C pendant 7 jours, et les colonies ont 6t6 d6nombr6es le 2 e et le 7 e jour. Un examen au microscope optique (Zeiss) a 6t6 effectu6, sur la dilution fi 1/100 des selles, au contraste de phase avec un objectif de 100 ~t immersion. La pr6sence de spores incluses dans les bacilles a 6t6 not6e. Les colonies pr6sum6es de Clostridium (colonies lenticulaires se d6veloppant en 48 h dans le milieu B' avec pr6sence de gaz dans le tube et colonies irr6guli~res ou lenticulo-irr6guli~res de taille variable se d6veloppant apr~s 48 h dans les milieux B' et D) ont 6t6 soit observ6es au microscope pour la confirmation du diagnostic, soit ensemenc6es apr~s chauffage h 70°C pendant 10 min en ampoule scell6e dans le milieu B' contenant 0,03 % de taurocholate de sodium (Calbiochem) comme facteur de germination et 0,5 07o de g61ose, au lieu de 1,5 070. Les cultures ont 6t6 ensuite ensemenc6es par dilution dans le milieu D, et un clone isol6 a 6t6 repiqu6 pour identification. Au total, 122 souches clon6es ont 6t6 iden-tifi6es selon les techniques d6crites par Sebald et Brefort [21] . L'antibiotype de 93 souches a 6t6 d6termin6 par la m6thode des disques avec 12 antibiotiques : p6nicilline, ampicilline, carb6nicilline, t6tracycline, 6rythromycine, rifampicine, clindamycine, kanamycine, m6tronidazole, acide nalidixique, c6foxitine et chloramph6nicol. Le nombre total de bact6ries cultivables retenu a 6t6 celui qui correspondait au nombre le plus 61ev6 de colonies dans l'un ou l'autre des deux milieux B' et D. Les rotavirus ont 6t6 recherch6s dans les selles de 87 nouveau-n6s par la m6thode ELISA [4] . Un examen au microscope 61ectronique a 6t6 pratiqu6 sur 59 selles, l'h6pital St-Vincent-de-Paul, pour la d6tection de la pr6sence 6ventuelle de rotavirus et de coronavirus. Le test 6picutan6 [5] utilisant la peau de lapin albinos << New-Zeland >> a 6t6 utilis6 pour la recherche d'un facteur de perm6abilit6 dans la dilution ~ 1/100 des selles congel6es, et les cultures de cellules VERO pour la recherche d'une cytotoxine dans les cultures de C. difficile. Les toxines 16tales 6ventuellement pr6sentes dans les illtrats de culture de Clostridium perfringens, C. sordellii et C. difficile ont 6t6 recher-ch6es par injection intrap6riton6ale de 0,5 ml d'un surnageant de culture de 18 hen bouillon TYG (IPP), h des souris males albinos de 18-20 g. La pr6sence 6ventuelle d'une substance toxique dans les parois de C. butyricum a 6t6 recherch6e selon la technique de Popoff et Sebald [16] . Le test du chi2 a 6t6 utilis6 lorsqu'il s'agissait de savoir si l'effectif des nouveau-n6s dans les diff6rentes classes 6tait lid ou non/l un crit6re donn6. Pour les valeurs num6riques continues: Apgar, age gestationnel, poids ~ la naissance, la moyenne et l'intervalle de confiance par classe de diagnostic ont 6t6 calcul6s au seuil de 5 °7o. Une analyse des correspondances selon la m6thode pr6conis6e par Jacob et coll. [10] a 6t6 effectu6e ~t partir du tableau de contingence croisant les 6 modalit6s de la variable M (M01 ~ M06) correspondant au diagnostic clinique et 23 autres variables, dont les modalit6s varient de 2/l 7 ( fig. 1 ). Ce tableau de contingence a 6t6 6tabli/l partir de donn6es recueillies chez 77 nouveau-n6s (tableau I) pour lesquels toutes les variables avaient 6t6 d6finies. Le tableau III montre qu'il n'y a pas de diff6rence significative quant au nombre total de bact6ries cultivables et au nombre de Clostridium (quel que soit le niveau de population consid6r6) pour les effectifs de nouveau-n6s ayant eu une stase intestinale (M01, M02, M03) et pour ceux de nouveau-n6s sans trouble digestif (M06). En revanche, chez les nouveau-n6s atteints de diarrh6e aiguE (M05), on a observ6 un nombre de bact6ries cultivables > 101°/g de selles, significativement moins souvent que chez les enfants de l'ensemble des classes M01, M02 et M03, et la pr6sence de Clostridium significativement moins souvent que chez tousles autres nouveau-n6s (tableau III). Si l'on consid&e les effectifs de nouveau-n6s h6bergeant un nombre 61ev6 de Clostridium, ils sont significativement plus faibles dans la classe M05 que dans l'ensemble des classes M01, M02 et M03 et plus 61ev6s dans cet ensemble que dans la classe M04 (colites h6morragiques) (tableau III). Le tableau IV indique qu'un traitement par les antibiotiques effectu6 juste avant le pr61~vement de selles ne peut pas ~tre consid6r6, dans ces essais, comme un facteur susceptible de masquer d'une fa~on significative la pr6sence de Clostridium dans les selles. Dans 82 % des selles, nous avons observ6 une concordance entre le nombre de Clostridium d6nombr6s et la pr6sence ou l'absence de spores dans des bacilles ~ l'examen direct de la dilution ~ 1/100. Dans Le tableau V indique la fr6quence d'isolement des diff6rems Clostridium dans les selles de nouveau-n6s des diff6rentes classes. Pour C. butyricum, l'esp6ce la plus fr6quemment identifi6e, il n'y a pas de diff6rence significative entre la fr6quence d'isolement chez les nouveau-n6s de l'ensemble des classes M01, M02 et M03, chez ceux de la classe M04 et chez ceux de la classe M06. Neuf selles seulement, sur les 67 off l'on a identifi6 les diff6rentes souches clon6es, contenaient 2 esp6ces ou plus de Clostridium diff6rentes: Dans aucune des 107 selles test6es, on n'a d6cel6 de facteur de perm6abi-lit6. Une souche de C. difficile sur les 13 test6es a 6t6 cytotoxique en culture; elle provenait d'un nouveau-n6 de la classe M03, alors que les souches n6gatives provenaient de nouveau-n6s des classes M01 (1) Les r6sultats que l'on peut tirer de l'analyse des correspondances, qu'illustre la figure 1, sont 1600. [25] , mais ne confirme pas l'hypo-th~se d'une origine virale retenue par certains [3, 19] . On voit aussi que l'analyse des correspondances oppose nettement les classes de nouveau-n6s atteints d'ECUN ~t celle des nouveau-n6s atteints de diarrh6e aigu~; cette derni6re regroupe, en effet, des nouveau-n6s ~g6s de moins de 8 jours, n6s ~t terme ou presque avec un poids 61ev6, sans troubles respiratoires ni cath6t6risme, dont les selles sont d6pourvues de Clostridium mais contiennent des virus (rotaet/ou coronavirus). Dans ce cas, un r61e primordial pourrait atre attribu6 aux virus de l'intestin et l'acc616ration du transit intestinal pourrait expliquer (1) l'absence fr6quente de Clostridium dans leurs selles et (2) le fait que leurs selles contiennent fr6quemment moins de 10 l° bact6ries/g. Lorsqu'on compare les effectifs de nouveau-n6s en fonction du nombre de Clostridium et du diagnostic clinique, ceux des nouveau-n6s atteints d'ECUN ne se distinguent pas significativement de ceux des nouveau-n6s qui ne souffrent d'aucun trouble intestinal. C'est ce qu'ont observ6 Westra-Meyer et coll. [24] . Ces auteurs et d'autres [1] pensent, d'autre part, que la pr6sence en nombre 61ev6 (> 109/g) de Klebsiella dans les selles constitue un facteur de risque important. Les observations que nous avons faites chez 2 nouveau-n6s aliment6s par voie parent6rale confirment les soupqons qui s'attachent ce genr e bact6rien. Les esp6ces de Clostridium que nous avons isol6es sont celles isol6es par d'autres [2, 9, 15, 22] , ~t l'exception de C. sordellii qui ne semble pas avoir 6t6 cit6 dans la litt6rature. Notons que les Clostridium dominants n'ont pas 6t6 cultiv6s dans 10 % des selles, soit que leurs spores aient besoin d'un facteur de germination absent des milieux B' et D, soit que leurs cellules v6g6tatives n'y croissent pas. Mais aucune de ces selles ne provenaient de nouveau-n6s des classes M01 et M02. Aucune esp6ce de Clostridium n'a 6t6 isol6e ~ une fr6quence plus grande que les autres chez les nouveau-n6s atteints d'ECUN. Ce fait apporte un argument suppl6mentaire g l'hypoth6se que I'ECUN n'est pas, dans tous les cas, une maladie d6clench6e par une esp~ce unique de Clostridium, produisant une toxine connue dans l'intestin, laquelle pourrait atre tenue pour responsable des alt6rations de la paroi intestinale. Toutefois, on peut concevoir que certaines souches bactdriennes --Clostridium, Klebsiella --jouent un r61e important lorsqu'elles sont associ6es d'autres facteurs de risque, notamment une perburbation de la motilit6 de l'intestin grale, aboutissant ~t une stase plus ou moins longue du bol alimentaire et donc ~ une ~ m6tabolisation)) bact6rienne ~ ce niveau. Cette stase est observ6e dans le cas des diagnostics M01, M02 et M03. Le fait que l'arr~t de l'alimentation par voie orale est consid6r6 par tous les p6diatres comme une n6cessit6 chez les nouveau-n6s pr6sentant les premiers signes d'une ECUN, est en faveur de cette hypoth6se. Toutefois, nous avons observ6 5 cas d'ent6rocolite avec pneumatose chez des nouveau-n6s en alimentation parent6rale. Mais ce type d'alimentation ne supprime pas pour autant le d6veloppement bact6rien dans l'intestin. Pour diminuer les risques inh6rents aux bact6ries intestinales, on pourrait envisager une d6contamination par antibioth6rapie. Mais le nombre 61ev6 d'antibiotypes diff6rents observ6 pour le seul genre Clostridiurn sugg6re qu'elle serait difficile g obtenir. On obtiendrait fort proba-blement une meilleure pr6vention chez les nouveau-n6s h risque en les pla-~ant, d~s la naissance, dans des isolateurs analogues ~t ceux con~us pour le transport de nouveau-n6s [23] . Cet isolement du nouveau-n6 aurait l'avantage de permettre la ma~trise de la colonisation bact6rienne de l'intestin, soit par 61imination, grfice ~ une d6contamination ~t la naissance [13] ou ~t une antibioth6rapie appropri6e, dirig6e contre les seules souches bact6riennes introduites avec le nouveau-n6 dans l'isolateur [18], soit par contr61e/~ l'aide d'un ensemencement de souches bact6riennes capables d'exercer un effet antagoniste contre les souches susceptibles de devenir pathog~nes chez le pr6matur6 ~t risque, par exemple Klebsiella ou Clostridium. I1 est en effet tr~s plausible que les premieres bact6ries qui s'installent ne soient pas potentiellement pathog~nes pour le pr6matur6, puisque souvent, et en particulier dans cette 6tude, les troubles intestinaux autres que les diarrh6es aiguEs apparaissent apr~s la premiere semaine de vie. Ce mode de pr6vention, d6jh sugg6r6 par Lawrence et coll. [14] , est consid6r6 comme inapplicable par Kosloke [12] , qui traduit sans doute l'opinion de la majorit6 des p6diatres. Pourtant, les am61iorations techniques apport6es ~t la construction des isolateurs devraient ~tre prises en compte. En rempla~ant l'ut6rus maternel par une enveloppe imperm6able aux agents microbiens, on pourrait esp6rer une meilleure r6paration des 16sions 6ventuelles de la paroi intestinale, la mise en place d'un transit intestinal normal et l'installation, au moment voulu, d'une flore intestinale appropri6e. Cent quinze nouveau-n6s, fig6s de 31 jours au plus et hospitalis6s dans deux unit6s de soins intensifs, ont 6t6 group6s en 6 classes d'apr~s le diagnostic clinique (ent6rocolite avec ou sans examen anatomopathologique et avec ou sans pneumatose radiologique, ¢~ colites h6morragiques >>, diarrh6e aigu~, absence de troubles digestifs). Le nombre total de bact6ries cultivables et le nombre de Clostridium ont 6t6 d6termin6s dans leurs selles. Dans certaines selles, on a 6galement recherch6 la pr6sence de rota-et/ou de coronavirus. Les effectifs de nouveau-n6s souffrant d'ent6rocolites, avec ou sans pneumatose, ou de colites h6morragiques dont les selles contiennent des Clostridium ne sont pas significativement diff6rents de ceux des nouveau-n6s sans trouble digestif, alors que les selles de nouveau-n6s atteints de diarrh6e aigu~ contiennent moins fr6quemment des Clostridium que celles des autres nouveau-n6s. Les Clostridium identifi6s appartiennent aux esp~ces C. butyricum, C. perfringens, C. difficile, C. tertium et C. sordellii. L'analyse des correspondances comparant la variable classe de diagnostic ~t 23 autres variables sug-g~re que les variables suivantes : g6mellit6, poids de naissance < 1900 g, fige gestationnel < 35 semaines, d6tresse respiratoire, pose d'un cath6ter ombilical et nombre de Clostridium > 107/g de selle ~t l'apparition des signes cliniques, soit entre le 8 e et le 12 e jour de vie, sont li6es au diagnostic d'ent6rocolite avec pneumatose. A l'oppos6, l'absence de g6mellit6, un poids de naissance et un fige gestationnel 61ev6s, l'absence de troubles respiratoires, de cath6- MOTS-CLES: Nouveau-n6, Clostridium, Diarrh6e; Analyse des correspondances, Ent6rite ulc6ron6crosante, Colite h6morragique. REMERCIEMENTS Nous remercions vivement M r G. Gorthier pour les conseils qu'il nous a pro-digu6s pour mettre en oeuvre le test ELISA, M me De Manneville pour l'aide pr6-cieuse qu'elle nous a apport6e dans l'analyse des selles de plusieurs nouveau-n6s Epidemiologic and bacteriologic evaluation of neonatal necrotizing enterocolitis Clostridia colonization and clostridial toxin in neonatal necrotizing enterocolitis Association of coronavirus infection with neonatal necrotizing enterocolitis Detection of rotavirus immune complexes : relationship between rotavirus antibodies and rotavirus antigens in faeces A permeability factor (toxin) found in cholera stools and culture filtrates and its neutralization by convalescent cholera sera Necrotizing enterocolitis in the very low birth weight infant: expressed breast milk feeding compared with parenteral feeding The role of host factors in an outbreak of necrotizing enterocolitis Evidence for an immune complex vasculitis in neonatal necrotising enterocolitis Outbreak of necrotising enterocolitis caused by Clostridium butyricum Analysis of the ecological niche of four species of the genus Phylloscopus Necrotizing enterocolitis Pathogenesis and prevention of necrotizing enterocolitis: a hypothesis based on personal observation and a review of the literature Accouchements st6riles Pathogenesis of neonatal necrotising enterocolitis Necrotising enterocolitis of the newborn. Is it gas-gangrene of the bowel ? Mise en 6vidence chez Clostridium butyricum d'un facteur thermostable responsable du pouvoir pathog~ne exp6rimental La microflore du tube digestif du rat. --I. Techniques d'6tude et milieux de culture propos6s Evolution de la flore bact~rienne f6cale d'un enfant << h6t6-rox6nique >> 61ev6 dans un isolateur et essai de d6contamination par antibio-th~rapie An outbreak ot rotavirus associated neonatal necrotizing enterocolitis Etude compar6e de la microflore de l'estomac, de l'intestin grSle et du caecum du rat > (conventionnel), et de ses modifications ~t la suite de diverses interventions chirurgicales: anse aveugle j6junale, d6viations biliaires Recherche et identification des ana6robies en bac-t6riologie courante Clinical and bacteriological findings in necrotising enterocolitis: a controlled Study Quantitative study of the aerobic and anaerobic faecal flora in neonatal necrotising enterocolitis Perinatal risk factors for necrotising enterocolitis