key: cord-0761214-wpswfi8k authors: Musiol-Kroll, Ewa M.; Wohlleben, Wolfgang title: Maßgeschneiderte Polyketidsynthasen zur Herstellung von Polyketid-Derivaten date: 2020-06-26 journal: BIOspektrum (Heidelb.) DOI: 10.1007/s12268-020-1416-0 sha: 9c64d1c83f71142a13ca3c506ea1f8776bdb7479 doc_id: 761214 cord_uid: wpswfi8k Polyketides (PKs) are secondary metabolites with valuable properties, including antibiotic, antifungal, antiviral, anticancer, and immunosuppressive activity. The biosynthesis of PKs is accomplished by multifunctional megaenzymes, the polyketide synthases (PKSs). The molecular architecture of those remarkable assembly lines provides opportunities for their engineering and generation of PK derivatives with potentially improved pharmacokinetics and/or expanded spectrum of bioactivity. rung der Polyketidkette verantwortlich ist, ausgestattet. Die "PKS-Maschinerien" können sich in ihrer molekularen Organisation, Domänenzusammensetzung und der mechanistischen Art und Weise unterscheiden. Um die diversen Systeme auseinanderzuhalten, wurde eine Klassifi zierung aufgestellt. Diese teilt die PKSs in drei Hauptklassen ein: Typ-I-PKSs (modulare Typ-I-PKSs und iterative Typ-I-PKSs) [5] , Typ-II-PKSs (iterativ) [6] und Typ-III-PKSs (Chalkonsynthasen, iterativ) [7] . Obwohl die modularen Typ-I-PKS-Systeme eine enorme Komplexität aufweisen und somit eine Herausforderung für detaillierte Analysen und das Engineering darstellen, erlangten sie eine große Aufmerksamkeit der Wissenschaftler. Dies ist auch für unsere Arbeitsgruppe, die sich für die Biosynthese des Polyketid-Antibiotikums Kirromycin [8] interessiert, der Fall. Im Folgenden wird am Beispiel von Kirromycin aus Streptomyces collinus Tü365 nicht nur die Komplexität der modularen Typ-I-"Polyketid-Maschinerien", sondern auch das Potenzial der ATs für die Entwicklung von neuen Polyketid-Derivaten exemplarisch aufgezeigt. Die Besonderheit der Kirromycin-Biosynthese beruht auf der einzigartigen Kombination der biosynthetischen Schlüsselenzyme. Es handelt sich hier um die KirAI-KirAVI-Maschinerie, die aus fünf modularen Typ-I-PKSs und zwei nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPSs) besteht (Abb. 1, [9] ). NRPSs arbeiten nach einem ähnlichen Prinzip wie die modularen PKS-Enzyme: Aktivierte Aminosäuren (AS) werden auf die Carrierproteine der NRPS geladen und während der schrittweisen Biosynthese in die wachsende Polyketid-bzw. Peptidkette eingebaut. In modular aufgebauten Typ-I-PKSs beinhaltet jedes Modul ein Set von enzymatischen Domänen, die für einen Zyklus der Polyketidkettenverlängerung benötigt werden. Diese sukzessive Polyketid-Biosynthese wird deswegen häufi g auch als "Fertigungsstraße" oder "Fließband-Biosynthese" ó Die steigende Anzahl von multiresistenten Keimen [1, 2] [13] . Die Ergebnisse dieser Studien demonstrieren die besondere Substrat-und ACP-Spezifi tät der KirCII-AT, die den "regiospezifischen" Einbau von verzweigten Vorstufen in eine Polyketidstruktur ermöglicht. Diese Eigenschaften machen KirCII zum potenziellen Werkzeug für die Polyketid-Derivatisierung. Die strukturelle Diversität der Polyketide wird durch die Heterogenität der PKS-Systeme erreicht. Zu den Faktoren, die über die Struktur der Polyketid-Produkte entscheiden, gehören die molekulare Architektur der PKSs (Typ der PKS, Zusammensetzung der Module und Kombination der Domänen) und die Post-PKS-Modifi kationsenzyme (tailoring enzymes). Relativ viele der strukturellen Variationen in Polyketiden sind jedoch auf die Substratspezifi tät der ATs und den verfügbaren Pool an Vorstufen zurückzuführen. In den vergangenen zwei Jahrzehnten wurde die strikte Korrelation der molekularen Architektur der modularen PKS und der Struktur der synthetisierten Polyketide (auch co-linearity principle genannt) verwendet, um die PKS zu manipulieren und so neue Polyketid-Derivate herzustellen. Zu den bekanntesten PKS-Engineering-Strategien gehören die Deletion, Insertion und der Austausch von kompletten Modulen oder einzelnen Domänen (mix and match oder plug and play) (Abb. 2). Die meisten dieser Modifi kationen wurden für die PKSs aus dem Erythromycin-Biosyntheseweg erfolgreich durchgeführt. Gleichzeitig sind einige dieser Ansätze für weniger erforschte Polyketid-Biosynthesewege gescheitert. Offensichtlich sind die modularen PKS-Systeme komplexer als ursprünglich gedacht und müssen noch genauer unter die Lupe genommen werden. Neuere Studien der Ko-Evolution der gigantischen modularen PKSs offenbarten, dass die optionalen Domänen (prozessierende Domänen) eher mit der in der PKS stromabwärts vorliegenden Domäne als mit der stromaufwärts liegenden Domäne verwandt sind [14] . Diese Erkenntnis provozierte die Hypothese, dass ein Modul nicht wie bislang den. KirCI fungiert als Malonyl-CoA-spezifische AT und belädt mit hoher Wahrscheinlichkeit die ACPs der KirAI sowie die ersten drei Module der KirAII, KirAIV und KirAV mit Malonat (Abb. 1, [11] ). Die Sub stratspezifi tät von KirCII hat sich als besonders interessant herausgestellt: KirCII agiert bei Standard-Kirromycin-Produktionsbedingungen als Ethylmalonyl-CoA-spezifi sche AT und transferiert Ethylmalonat nur auf ein einziges ACP des Kirromycin-Multienzymkomplexes, das ACP im Modul 5 (ACP5) (Abb. 1, [11] ). Weitergehende in vitro-Analysen des KirCII-Enzyms offenbarten, dass die AT in der Lage ist, zuzüglich zu Ethylmalonat auch alternative Vorstufen, wie Allyl-und Propargylmalonat und in geringerem Maße Phenylund Azidoethylmalonat, auf ACP5 zu transferieren. Darüber hinaus konnte der Einbau von Allyl-und Propargylmalonat in in vivo-Fütterungsstudien bestätigt werden. Die Experimente führten zur Isolierung von zwei Kirromycin-Derivaten, Allyl-und Propargyl-Kirromycin (Abb. 1, [13] ). Letzteres besitzt eine Dreifachbindung (Alkingruppe), die sich besonders für Klick-Chemie-Reaktionen eignet und eine weitere Derivatisierung der Polyketidstr uktur möglich macht. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von bezeichnet. Dabei ist die essenzielle AT-Domäne in der Regel in die PKS-Enzyme "eingebettet" (cis-AT-PKS). Die AT-losen PKSs (trans-AT-PKS) [10] stellen jedoch eine Ausnahme dar. Im Kirromycin-Biosyntheseweg wurden nicht nur NRPS-Module, sondern auch beide PKS-Subtypen im Laufe der Evolution miteinander kombiniert. KirAI-KirAV sind AT-los und werden somit dem trans-AT-PKS-Subty p zugeordnet, KirAIV ist dagegen vom cis-AT-PKS-Subtyp (Abb. 1). Des Weiteren haben Genomsequenzanalysen ergeben, dass im Kirromycin-BGC zwei Gene, kirCI und kirCII, vorliegen, deren Genprodukte Ähnlichkeit zu Acyltransferasen zeigten. Demzufolge stellten sich die Fragen: Sind beide Enzyme (KirCI und KirCII) als eigenständige ATs aktiv? Mit welchen trans-AT-PKS interagieren sie, und welche Substratspezifi tät liegt vor? Die Funktion und Substratspezifität von KirCI und KirCII wurden auf genetischer und biochemischer Ebene untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten, dass KirCI und KiCII essenziell für eine effi ziente Kirromycin-Produktion sind [11, 12] . Beide Enzyme konnten in biochemischen Assays (ACP-Beladungsassays) als eigenständige ATs bestätigt wer- behauptet die Sequenz von der KS bis zur ACP (KS + AT + [DH + ER + KR] + ACP) hat, sondern mit einer AT "beginnt" und einer KS "endet" (AT + [DH + ER + KR] + ACP + KS) [15] . Es wird sich sicherlich in der Zukunft klären, ob die Implementierung der neu definierten Grenzen der PKS-Module die Verbindungsstelle des stromaufwärts liegenden ACP zu der stromabwärts befi ndlichen KS aufrechterhalten kann und die häufi g auftretenden Engineering-Probleme lösen wird. Tatsächlich konnte bereits für die nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen [16] , die den PKSs sehr ähnlich sind, und die trans-AT-PKSs [14] Antibiotic Resistance No Time to Wait: Securing the future from drug-resistant infections World Health Organization. Coronavirus disease (COVID-2019) situation reports Structure of a modular polyketide synthase Iterative polyketide biosynthesis by modular polyketide synthases in bacteria Type II polyketide synthases: gaining a deeper insight into enzymatic teamwork The chalcone synthase superfamily of type III polyketide synthases Kirromycin, an inhibitor of the 30S ribosomal subunits function Molecular analysis of the kirromycin biosynthetic gene cluster revealed beta-alanine as precursor of the pyridone moiety Discrete acyltransferases involved in polyketide biosynthesis The AT(2) domain of KirCI loads malonyl extender units to the ACPs of the kirromycin PKS Supramolecular templating in kirromycin biosynthesis: the acyltransferase KirCII loads ethylmalonyl-CoA extender onto a specifi c ACP of the trans-AT PKS Polyketide bioderivatization using the promiscuous acyltransferase KirCII The modules of trans-acyltransferase assembly lines redefi ned with a central acyl carrier protein Polyketide synthase modules redefi ned De novo design and engineering of non-ribosomal peptide synthetases Funding: Open Access funding provided by Projekt DEAL.