key: cord-0746980-z4xwuxef authors: Jaegle, Mike; Wong, Ee Lin; Tauber, Carolin; Nawrotzky, Eric; Arkona, Christoph; Rademann, Jörg title: Proteintemplat‐gesteuerte Fragmentligationen – von der molekularen Erkennung zur Wirkstofffindung date: 2017-05-31 journal: Angew Chem Weinheim Bergstr Ger DOI: 10.1002/ange.201610372 sha: 5cafd054855602e3c43d1c348e2ccae22b576be3 doc_id: 746980 cord_uid: z4xwuxef Proteintemplat‐gesteuerte Fragmentligationen sind ein neuartiges Konzept zur Unterstützung der Wirkstofffindung und können dazu beitragen, die Wirksamkeit von Proteinliganden zu verbessern. Es handelt sich dabei um chemische Reaktionen zwischen niedermolekularen Verbindungen (“Fragmenten”), die die Oberfläche eines Proteins als Reaktionsgefäß verwenden, um die Bildung eines Proteinliganden mit erhöhter Bindungsaffinität zu katalysieren. Die Methode nutzt die molekulare Erkennung kleiner reaktiver Fragmente durch die Proteine sowohl zur Assemblierung der Liganden als auch zur Identifizierung bioaktiver Fragmentkombinationen. Chemische Synthese und Bioassay werden dabei in einem Schritt vereint. Dieser Aufsatz diskutiert die biophysikalischen Grundlagen der reversiblen und irreversiblen Fragmentligationen und gibt einen Überblick über die Methoden, mit denen die durch das Proteintemplat gebildeten Ligationsprodukte detektiert werden können. Der chemische Reaktionsraum und aktuelle Anwendungen wie auch die Bedeutung dieses Konzeptes für die Wirkstofffindung werden erörtert. Protein-bindende,b ioaktive Moleküle sind die Ausgangspunkte fürz ukünftige Arzneistoffe und werden in den meisten Fällen in zwei klar voneinander getrennten Schritten identifiziert und optimiert:Z unächst werden niedermolekulare Verbindungen synthetisiert oder aus natürlichen Quellen isoliert, danach werden ihre biochemischen Eigenschaften in biologischen Te stverfahren (Bioassays) untersucht (Abbildung 1A). Beide Schritte kçnnen im Zuge des Optimierungsprozesses iterativ durchlaufen werden. Dementsprechend ist die klassische Leitstruktursuche durch eine strikte Tr ennung zwischen der Synthese und Zusammenstellung von "chemischen Bibliotheken" und deren Durchmusterung ("Screening") auf biologische Aktivitätd urch Protein-basierte oder zelluläre Assays charakterisiert. Im Laufe der letzten 20 Jahre entwickelte sich jedoch ein alternatives Konzept der Wirkstoffentdeckung,d as auf die Vereinigung der chemischen Synthese und der biologischen Te stung in einem Schritt abzielte. [1] [2] [3] Dieser Ansatz nutzt die molekulare Erkennung von reaktiven, niedermolekularen Fragmenten durch Proteine sowohl zur Assemblierung der chemischen Liganden als auch zur Identifizierung von bioaktiven Fragmentkombinationen und wird daher als "Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligation" bezeichnet (Abbildung 1B). Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligationen bieten aus mehreren Gründen eine vielversprechende Alternative zur klassischen Wirkstofffindung:D urch die Zusammenführung von chemischer Synthese und Bioassay zu einem Schritt kann der anschließende Syntheseaufwand auf die Herstellung der aktivsten Fragmentkombinationen beschränkt werden. Daher zeichnet sich die Methode durch eine hohe Effizienz aus und spart Zeit, Geld, Arbeitskraft und chemische Ressourcen. Bereits kleine Bibliotheken von wenigen Hundert bis Tausend reaktiven Fragmenten reichen aus,u md en rele-vanten chemischen Raum abzudecken sowie eine riesige Anzahl an mçglichen Fragmentkombinationen und Fragmentligationsprodukten zu untersuchen. Zudem ermçglichen Fragmentligationen die Detektion von schwach affinen Fragmenten füre ine räumlich aufgelçste Proteinbindungsstelle.D ies ist mçglich, weil die Bindung des reaktiven Primärfragments oder der Proteinsonde die Bindung des Sekundärfragments an einem genau definierten Ort verstärkt. In diesem Aufsatz werden wir den aktuellen Stand sowie das Potenzial von Proteintemplat-gesteuerten Fragmentligationen in der Wirkstofffindung darstellen. Dazu schlagen wir zunächst eine umfassende Definition der Proteintemplat-gesteuerten Fragmentligationen vor: Chemische Reaktionen zwischen zwei oder mehr niedermolekularen Verbindungen ("Fragmenten"), welche die Proteinoberfläche als Katalysator nutzen, um die Bildung von Proteinliganden mit erhçhter Bindungsaffinitätz ub eschleunigen, werden als Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligationen bezeichnet. Diese Definition umfasst sowohl reversible als auch irreversible Ligationsreaktionen. Wirhalten es fürsinnvoll, beide Reaktionstypen zusammen zu betrachten, da alle Te mplatgesteuerten Ligationen denselben biophysikalischen Gesetzen unterliegen, dieselben Anforderungen an die Detektion der Ligationsprodukte stellen und eindrucksvolle Beiträge Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligationen sind ein neuartiges Konzept zur Unterstützung der Wirkstofffindung und kçnnen dazu beitragen, die Wirksamkeit von Proteinliganden zu verbessern. Es handelt sichdabei um chemische Reaktionen zwischen niedermolekularen Verbindungen ("Fragmenten"), die die Oberfläche eines Proteins als Reaktionsgefäßv erwenden, um die Bildung eines Proteinliganden mit erhçhter Bindungsaffinitätz ukatalysieren. Die Methode nutzt die molekulare Erkennung kleiner reaktiver Fragmente durch die Proteine sowohl zur Assemblierung der Liganden als auch zur Identifizierung bioaktiver Fragmentkombinationen. Chemische Synthese und Bioassay werden dabei in einem Schritt vereint. Dieser Aufsatz diskutiert die biophysikalischen Grundlagen der reversiblen und irreversiblen Fragmentligationen und gibt einen Überblick über die Methoden, mit denen die durch das Proteintemplat gebildeten Ligationsprodukte detektiert werden kçnnen. Der chemische Reaktionsraum und aktuelle Anwendungen wie auchd ie Bedeutung dieses Konzeptes fürdie Wirkstofffindung werden erçrtert. mentligationsassays darstellt (Abschnitt 3). In Abschnitt 4 geben wir einen Überblick über die bisherigen chemischen Reaktionen, die füre ine Te mplat-gesteuerte Ligation verwendet wurden, und diskutieren mçgliche zukünftige Erweiterungen des bestehenden Reaktionsrepertoires.R eversible Reaktionen, die im Rahmen der dynamisch-kombinatorischen Chemie untersucht wurden, [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] sowie irreversible Reaktionen, die auch als Ziel-geleitete Synthesen (targetguided synthesis,T GS) bezeichnet worden sind, [15] werden zusammen behandelt, da beide Reaktionsarten Beispiele für Te mplat-gesteuerte Ligationen liefern und die genaue Einordnung einer chemischen Reaktion in eine der beiden Kategorien oft schwierig ist. Repräsentative aktuelle Anwendungen von Te mplat-gesteuerten Ligationen in der Fragmentbasierten Wirkstofffindung (FBWF) werden in Abschnitt Die Additivitätd er freien Bindungsenergien (Gibbs-Energien) stellt dabei die treibende Kraft der Proteintemplatgesteuerten Fragmentligationen dar (Abbildung 3). [16, 17] Zwei Fragmente binden unabhängig und ohne Überlappungen mit den freien Bindungsenergien DG 1 bzw. DG 2 an ein Protein. [18] Werden die beiden Fragmente nun durch eine reversible oder irreversible chemische Reaktion miteinander verknüpft, ergibt sich eine freie Bindungsenergie fürd as gebildete Ligationsprodukt von DG lig = DG 1 + DG 2 + X,wobei X fürden Wert der Abweichung von der Addition der Bindungsenergien steht. Fürd en Fall, dass die kovalente Verknüpfung zweier Fragmente zur strikten Additivitätder Bindungsenergien führt (X = 0), erhält man die resultierende Bindungsaffinität( K D )d er Fragmentkombination als Produkt der Bindungsaffinitäten der Ausgangsfragmente: K D = e ÀDG/RT = K D1 K D2 . [19, 20] Haben zwei Fragmente z. B. einen K D -Wert von 1mm,e rgibt sich als resultierende Bindungsaffinitätd es Ligationsprodukts ein K D -Wert von 1 mm.B edingt durch zusätzliche,v om Linker beigetragene Bindungsenergie oder aufgrund des erfolgten Entropiegewinns kçnnen Fragmentkombinationen auch eine massive Superadditivitätd er Bindungsenergien aufweisen, was eine noch stärkere Erhçhung der Bindungsaffinitäten zur Folge hat. [19] Gleichermaßen kann die Verknüpfung von zwei Fragmenten die freie Bindungsenergie des Ligationsprodukts reduzieren, wenn der Linker die Bindung erschwert. Einige der klassischen Analysemethoden wurden bereits breit fürd ie Detektion von Te mplat-gesteuerten Fragmentligationen eingesetzt oder daran angepasst (Abbildung 4). In den meisten Arbeiten wurden chromatographische Methoden verwendet, gewçhnlich in Kombination mit Massenspektrometrie-gekoppelter Flüssigchromatographie (LC-MS). [13, [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] In einigen Beispielen wurden speziell entwickelte NMR-Methoden genutzt. [31] [32] [33] [34] [35] [36] Außerdem wurden Fragmentligationen rçntgenkristallographisch untersucht. [37] [38] [39] [40] [41] [42] Als wichtige Ergänzung wurde in den letzten Jahren die Detektion von Ligationsprodukten durch verschiedene Bioassays entwickelt. [1, 10, [43] [44] [45] [46] [47] [48] Die Detektion von Fragmentligationsprodukten durch LC-MS wurde in den letzten 20 Jahren durch die rasante Entwicklung dieser Methode deutlich erleichtert, sowohl im Hinblick auf die chromatographische Tr ennung als auch hinsichtlich der Empfindlichkeit der Massendetektoren. [13, [25] [26] [27] [28] Dabei wurden nicht nur die Detektion, sondern auch die Quantifizierung und die Strukturaufklärung der Ligationsprodukte durch den Einsatz von Extracted-Ion-oder Single-Ion-Chromatographie sowie MS-MS erheblich verbessert. Einige Einschränkungen bestehen jedoch weiterhin. Da die chromatographische Tr ennung Zeit bençtigt, eignet sich die Detektion mit LC-MS am besten fürirreversible oder quasi-irreversible Reaktionen. [15, 49] Im Fall von reversibel gebildeten Ligationsprodukten kann deren Fixierung durch eine chemische Reaktion oder die Verschiebung des pH-Werts eine Option sein. Diese Strategie wurde z. B. in der grundlegenden Arbeit von Huc und Lehn über "virtuelle chemische Bibliotheken" verfolgt, in der instabile Imin-Ligationsprodukte durch chemische Reduktion zu stabilen Aminen umgesetzt wurden. [21] Eine zweite Einschränkung der LC-MS-Detektion kann sich durch das in der Fragmentligation verwendete Puffersystem ergeben. Viele der in den Ligationsassays verwendeten Pufferionen stçren die Detektion des Ligationsprodukts im Massendetektor,w ohingegen LC-MS-geeignete Puffersalze,b eispielsweise Ammoniumformiat oder -acetat, durch Versetzen mit einem großen Überschuss an reaktiven Nukleophilen wiederum die Ligationsreaktion beinträchtigen kçnnen. In den letzten Jahren hat sich die native Massenspektrometrie zu einer ausgereiften Detektionsmethode im Bereich der Proteinbindenden Fragmente entwickelt. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass diese Te chnik auch bei der Detektion von Fragmentligationsprodukten ihren Einzug halten wird. [50] [51] [52] [53] Gegenüber LC-Methoden hat die NMR-Spektroskopie den großen Vorteil, dass die erfolgte Ligation direkt in der Assaylçsung nachgewiesen werden kann. Da fürd ie klassische NMR-Spektroskopie jedoch eine hohe Konzentration des Ligationsprodukts (mm)ineinem Volumen von etwa 0.5 mL bençtigt wird, damit eine chemische Analyse durchgeführt werden kann, sind auch dementsprechend hohe Proteinmengen vonnçten. [54] Daher ist die Methode nur anwendbar, wenn große Mengen an Protein zur Verfügung stehen und nur wenige Experimente mit geringem Durchsatz durchgeführt werden sollen. Durch Einsatz eines Gemisches reaktiver Fragmente kann der Durchsatz erhçht werden, wenn die Fragmentligation reversibel und kovalent verläuft. [33, [55] [56] [57] Diese Gemische werden als dynamischkombinatorische Bibliothek (DKB) oder dynamisch-kova-lente Bibliothek bezeichnet, und mit ihnen ist es prinzipiell mçglich, alle potenziellen Kombinationen der eingesetzten Fragmentbausteine zu erzeugen. Wird z. B. eine Anzahl von n und m verschiedenen komplementären Fragmenten eingesetzt, kçnnen bis zu n m unterschiedliche Produkte erhalten werden. Das Proteintemplat verschiebt das Gleichgewicht zugunsten des am stärksten gebundenen und daher auch am besten stabilisierten Ligationsprodukts.D ieses kann anschließend durch eine der klassischen Detektionsmethoden nachgewiesen werden. Mehrere NMR-Methoden wurden speziell an die Detektion von Fragmentligationsprodukten angepasst. So untersuchten Ramstrçm et al. mittels 1 H-STD-NMR-Spektroskopie die Proteintemplat-gesteuerte Bildung von Halbthioacetalen in wässrigem Milieu (Abbildung 5). [58] 1 H-STD-NMR-Spektroskopie nutzt den selektiven Tr ansfer von Proteinmagnetisierung auf einen reversibel gebundenen Liganden, was in diesem Beispiel dazu verwendet wurde,u mb indende Fragmente einer DKB zu identifizieren. Fürd en generellen Machbarkeitsnachweis wurde das Zielprotein b-Galactosidase gewählt, das die Hydrolyse von O-b-Galactosiden katalysiert und keinen Cystein-Aminosäurerest im aktiven Zentrum enthält. Ein Gemisch aus fünf Thiolen und zwei Aldehyden wurde verwendet, was zu einer mçglichen Bildung von zehn unterschiedlichen Halbthioacetalen führte.1-b-Mercapto-d-galactose zeigte dabei eine stärkere Bindung an das Zielprotein als die vier anderen Thiole und vergrçßerte die Signale beider Aldehyde im STD-Spektrum stark -v ermutlich durch die Bildung von Halbthioacetalen. Überraschend war, dass die Bindung der beiden Zucker nicht durch Zugabe des Substrats verhindert werden konnte,was darauf schließen lässt, dass zusätzliche allosterische Bindungsstellen fürd ie beiden Fragmente vorhanden sind. Eine der Thiol-Aldehyd-Kombinationen führte zu einer deutlichen Abnahme des Substratumsatzes und weist damit ebenfalls auf die Bildung von Halbthioacetalen als aktiven Inhibitoren hin. Ein weite-res Anwendungsbeispiel von STD-NMR-Spektroskopie wurde kürzlich von der Gruppe um Hirsch publiziert. [36] In einer aktuellen Verçffentlichung von Leung et al. konnten Fragmentligationsprodukte mittels 11 B-NMR-Spektroskopie nachgewiesen werden (siehe Abbildung 10, Abschnitt 5). [59] Außer den Liganden-basierten NMR-Methoden wurden auch die Protein-basierten NMR-Methoden intensiv zur Detektion von Proteinbindenden Fragmenten eingesetzt. [60, 61] Protein-NMR-Spektroskopie nutzt in vielen Fällen Proteine,d ie mit 13 C-und 15 N-Isotopen hergestellt worden sind, um damit eine Verstärkung des NMR-Signals zu erreichen. Die Bindung von Fragmenten kann anschließend z. B. in 2D-HSQC-Experimenten bestimmt werden, indem die ¾nderungen der chemischen Verschiebung untersucht werden. Die Methode wurde als "Struktur-Wirkungs-Beziehung durch NMR-Spektroskopie" vorgestellt und hat den großen Vorteil, dass auch Informationen zur Bindungsstelle des Fragments gewonnen werden kçnnen, wenn die Signale im NMR-Spektrum der Proteinstruktur zugeordnet werden. [62] Protein-basierte NMR-Spektroskopie kann auch eine hilfreiche Methode zur Untersuchung von Fragmentligationen sein, jedoch konnten von uns bisher keine Anwendungen dazu gefunden werden. Rçntgenkristallographie findet breite Anwendung im Bereich der Fragment-basierten Wirkstofffindung.D ie Attraktivitätd er Methode beruht dabei auf den detaillierten Strukturinformationen, die vom Fragment-Protein-Komplex erhalten werden. [63] Diese Informationen kçnnen beim Design von Fragmentkombinationsprodukten enorm hilfreich sein. In einigen Arbeiten wurde bereits die Proteinkristallographie zur Detektion von Fragmentligationsprodukten verwendet. [37] [38] [39] [40] [41] [42] Die schnelle und parallele Detektion von potenten Fragmentligationsprodukten wurde schließlich durch die Einführung von Aktivitäts-basierten Bioassays erreicht. Die Strategie wurde zunächst als dynamisches Ligations-Screening (DLS) bezeichnet, da anfangs reversible Ligationsreaktionen untersucht wurden. DLS erhçhte die Empfindlichkeit, mit der Liganden detektiert werden kçnnen, erheblich, und so konnten durch ortsaufgelçstes Screening niedrigaffine Fragmente mit K D -Werten im millimolaren Bereich gefunden werden (Abbildung 6). [10, 43] Aktivitäts-basierte Detektionsmethoden bençtigen nur minimale Mengen an Protein;g ewçhnlich reichen bereits Konzentrationen im niedrigen nanomolaren Bereich aus.S ie kçnnen mit der Standardausstattung fürb iochemische Assays,b eispielsweise Mikrotiterplatten und automatisierte Pipettierstationen zum Transfer der Fragmentbibliotheken, durchgeführt werden. Bei enzymatischen Assays ist die Empfindlichkeit durch die katalytische Aktivitätdes Zielproteins noch zusätzlich erhçht, da ein schneller Umsatz von vielen fluorogenen/chromogenen Sub-stratmolekülen erfolgt. Resonanter Fluoreszenzenergietransfer (FRET) konnte ebenfalls zur Detektion von Fragmentkombinationen eingesetzt werden. [44] Um die hçchste Empfindlichkeit zu erreichen, muss das reaktive,p rimäre Fragment in einer Assaykonzentration eingesetzt werden, die zu 10-20-prozentiger Inhibition führt und dadurch ein Messfenster von 80-90 %z ur Detektion der verstärkten Inhibition nach Versetzen mit dem sekundären Fragment offen lässt. Mittlerweile sind verschiedene Formate von Bioassays an das dynamische Ligations-Screening angepasst worden (Abbildung 7). Wieb ereits beschrieben, kann ein fluorogenes Substrat in einem Kompetitionsassay verwendet werden, wo es mit dem Fragmentligationsprodukt um die Bindungsstelle am Protein konkurriert. In diesem Assay führt die beste Fragmentkombination zur stärksten Inhibition der enzymatischen Reaktion (Abbildung 7A). Alternativ kann auch das Substrat selbst eine reaktive, funktionelle Gruppe tragen, die sich zur Fragmentligation eignet. Das angeknüpfte Fragment kann dabei zu einer Erhçhung der Substrataffinitätz um Zielprotein führen. Derartige Substrat-Verstärkungsassays (Abbildung 7B)e rmçglichen die ortsaufgelçste Identifizierung von Fragmenten, die an sekundäre Bindungsstellen binden und dadurch zu einem beschleunigten Substratumsatz führen. [45] Mit diesem Assayformat kçnnen auch kompetitiv bindende Liganden erfasst werden. Im speziellen Fall, dass das reaktive,f luorogene Molekülo hne angeknüpftes Fragment komplett inaktiv ist, wurde es als ein Präsubstrat bezeichnet, das sich besonders für die empfindliche Detektion von kurzlebigen, chemisch instabilen Ligationsprodukten, z. B. von Halbacetalen und Halbthioacetalen, eignet. [46] Die Methode wurde eingesetzt, um Fragmente zu identifizieren, die an sekundäre Bindungsstellen von Serinproteasen [46] und Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs) [45] binden. Im Fall der Protein-Tyrosin-Phosphatasen konnten so spezifische,s ekundäre Bindungstaschen besetzende Fragmente gefunden werden, die als Startpunkt fürP TP-spezifische Inhibitoren genutzt wurden. Das Prinzip der Bioaktivitäts-basierten Detektion von Fragmentligationsprodukten konnte von enzymatischen Abbildung 6. Konzept des dynamischen Ligations-Screenings (DLS). Ein fluorogenes Substrat konkurriert mit dem reaktiven, inhibitorischenF ragment 1u mdas aktive Zentrum der Protease. Zugabe des reaktiven Fragments 2f ührt zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zugunsten der kovalenten Verknüpfung der beiden Fragmente auf der Oberfläche des Proteins, was wiederum mit einer Erhçhungder Inhibition einhergeht. Assays auch auf Proteinbindungsassays ausgeweitet werden, wodurch die Identifizierung von Liganden nichtenzymatischer Bindungsstellen mçglich wurde.Proteinbindungsassays kçnnen prinzipiell in homogener Lçsung oder in einem heterogenen System durchgeführt werden, wenn einer der Bindungspartner zuvor auf einer Festphase oder Oberfläche immobilisiert wurde.E in homogener Bindungsassay für Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligationen konnte z. B. durch Detektion mittels Fluoreszenzpolarisation (FP), auch bekannt als Fluoreszenzanisotropie,e ntwickelt werden (Abbildung 7C,D). [47] Rolle in zukünftigen Projekten spielen wird -obwohl sie hohe Proteinmengen bençtigt und sich nur fürA nwendungen mit geringem Durchsatz eignet. [67] [68] [69] [70] Auch heterogene Proteinbindungsassays wurden zur Untersuchung von Protein-bindenden Fragmenten eingesetzt. Bei diesen Methoden werden unmarkierte Fragmente eingesetzt, jedoch ist eine kovalente Immobilisierung oder die Bindung an eine Affinitätssonde, wie Biotin, erforderlich. [71] [72] [73] [74] Kürzlich konnte die Bioaktivitäts-basierte Detektion von Fragment-Ligationsprodukten sogar auf die gegenüber Proteinassays noch deutlich komplexeren Zellexperimente ausgeweitet werden. [75, 76] Maki et al. berichteten von der intrazellulären Bildung von Inhibitor 3 des Proteins 14-3-3 durch eine intrazelluläre Oximligation (Abbildung 8). 14-3-3 wechselwirkt über Protein-Protein-Interaktionen (PPIs), die besonders schwer zu inhibieren sind, da die Wechselwirkungen von großen und dynamischen Interaktionsflächen von Molekülen unterbrochen werden müssen, die über zelluläre Aufnahme an den Wirkort gelangen müssen. Die Autoren konnten dabei feststellen, dass reaktive Aldehydderivate von Fusicoccin A( Fc, 1)a ne ine hydrophobe Tasche binden, die benachbart zur Bindungsstelle des Peptids 2 ist, das seinerseits eine Hydroxylamingruppe trägt. Es konnte in vitro gezeigt werden, dass in Gegenwart von Protein 14-3-3 eine Te mplat-gesteuerte Bildung des hetero-bivalenten Ligationsprodukts 3 erfolgte,d as sich als potenter Oximinhibitor herausstellte.A ls Nächstes wurde die intrazelluläre Bildung von 3 in stabil transformierten HEK293-Zellen (Flag-14-3-3z-Zelllinie) untersucht. Durch Hochleistungs-Flüssigchro-matographie (HPLC) konnte nachgewiesen werden, dass 3 in Zellen, die mit 1 und 2 behandelt wurden, gebildet wurde und zum stärksten zytotoxischen Effekt führte.D ie chemisch synthetisierte Referenzverbindung 3 zeigte hingegen keine Aktivität, vermutlich wegen des erhçhten Molekulargewichts, das die Aufnahme in die Zellen erschwert (Abbildung 8). [77] Somit zeigt diese Studie,d ass auch grçßere Moleküle,d ie potenziell dazu in der Lage sind, PPIs zu modulieren, durch intrazelluläre Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligation gebildet werden kçnnen. Insgesamt haben die erheblichen Fortschritte bei den Detektionsmethoden in den letzten Jahren -b esonders bei den Bioaktivitäts-basiertenM ethoden, aber auch bei den klassisch analytischen sowie den biophysikalischen Detektionsmethoden -d ie Identifizierung bioaktiver Fragmentligationsprodukte in Proteinbindungsassays wie auch in den enzymatischen und zellulären Assays erheblich erleichtert. Diese Entwicklung wird zukünftig die Entdeckung weiterer Beispiele von Templat-gesteuerten Fragmentligationen ermçglichen und damit zu einer erfolgreichen Anwendung der Fragmentligationsassays beitragen. Halbacetale und Halbthioacetale werden durch Te mplat-gesteuerte Fragmentligation von Aldehyden mit Alkoholen bzw.T hiolen Abbildung 8. A) Intrazelluläre Bildung des Protein-14-13-3-Inhibitors 3 durch Proteintemplat-gesteuerte Oximligation. B) Zytotoxizitätsassay von HEK293:Flag-14-3-3-z-Zellen wurden mit Konzentrationen von jeweils 20 mm der Verbindung 1, 2, 3 sowie 1 und 2 kombiniert behandelt. C) HPLC-Analytikder intrazellulären Bildung des Oximligationsprodukts 3. [77] Angewandte Chemie Aufsätze schnell in wässriger Lçsung gebildet, obwohl sie nicht als stabile Ligationsprodukte isoliert werden kçnnen. [46, 58, 78, 79] Die Bildung von Halbacetalen und Halbthioacetalen als Ligationsprodukte ist durch den mit dem Heteronukleophil konkurrierenden, hohen molaren Überschuss an Wasser (55 m)e rschwert, das Hydrate als alternative Reaktionsprodukte liefert. Ungeachtet dessen konnte mittels NMR-Spektroskopie [58] und Bioaktivitäts-basierterAssays nachgewiesen werden, dass das Proteintemplat dazu in der Lage ist, das Ligationsgleichgewicht zu verschieben und damit die Identifizierung von Halbacetalen und Halbthioacetalen als Ligationsprodukte zu ermçglichen. [46] Anders als fürd ie Halbacetale/Halbthioacetale konnte bisher keine Bildung von Vollacetalen/Dithioacetalen durch die Addition von zwei Alkohol-bzw.Thiolnukleophilen an eine Carbonylgruppe in Form einer Te mplat-gesteuerten Reaktion nachgewiesen werden, was aber wegen der hohen Aktivierungsenergie des carbokationischen Intermediats auch nicht erwartet werden kann. [80] [81] [82] Viele der Templat-gesteuerten Ligationen umfassen die Reaktion eines Stickstoff-Nukleophils mit einem Carbonyl-Elektrophil. Die Addition von primären Aminen an Aldehyde führt dabei zu Halbaminalen als Intermediate,d ie danach zu Iminen weiterreagieren. [126, 127] Die Bildung von Iminen ist ebenfalls ein Prozess mit schneller Gleichgewichtseinstellung,e rfordert aber ein unprotoniertes Amin, um ausreichende Reaktivitätzugewährleisten. [10, 43, 44, 46, 47, 83, 84] Daher ist die Reaktion vom pK S -Wert des Amin-Nukleophils und dem pH-Wert des Reaktionspuffers abhängig.Imine sind, besonders wenn aromatische Amine eingesetzt werden, erheblich stabiler als Halbacetale und kçnnen in bestimmten Fällen sogar isoliert werden. Als Konsequenz aus der erhçhten Stabilitätv on Iminen kann die Gleichgewichtseinstellung einer entsprechenden DKB jedoch erheblich langsamer erfolgen als bei Halbacetalen und Halbthioacetalen. Die Stabilitätv on Amin-Aldehyd-Ligationsprodukten kann weiterhin erhçht werden, wenn ein Aldehyd eingesetzt wird, der CH-acide Wasserstoffatome in a-Position trägt, wodurch die Bildung des entsprechenden Enamins mçglich ist. Eine andere Option besteht in der chemischen Fixierung des Imins durch eine irreversible Folgereaktion, beispielweise durch reduktive Aminierung,m it sekundären Aminen als Reaktionsprodukt. [86, 99] Die Stabilität der Ligationsprodukte von Aldehyden mit Stickstoff-Nukleophilen ist noch hçher, wenn Hydroxylamine,H ydrazine oder Acylhydrazide eingesetzt werden. [14, 77, 86-97, 100, 125] Die als Produkt gebildeten Oxime bzw.(Acyl-)Hydrazone sind unter physiologischen pH-Bedingungen stabil und kçnnen mithilfe gängiger Verfahren (z. B. Säulenchromatographie) aufgereinigt werden. Dementsprechend ist jedoch die Gleichgewichtseinstellung der Ligationsreaktion sehr langsam, oder es wird Anilin als Katalysator zugesetzt, um die Oxim-oder Hydrazonbildung zu beschleunigen. [86, 87, 89, 99] Alternativ kann die Gleichgewichtseinstellung von Acylhydrazonen auch durch Säurezugabe vorangetrieben werden. [98] Andere Ligationen von Heteronukleophilen mit Aldehyden sind denkbar,m üssen aber noch weitergehend untersucht werden. Beispielweise reagieren Thiole mit Iminen zu N,S-Acetalen, wobei das dabei entstehende Ligationsgleichgewicht durch Versetzen mit einem Proteintemplat verschoben werden kann. [43, 46, 112] Die Bioaktivitätsdaten lassen darauf schließen, dass die trimeren Komplexe aus Aldehyd, Amin und Thiol eine stärkere Affinitätz um Zielprotein haben, was sich durch einen reduzierten K M -Wert und durch erhçhten Substratumsatz äußert. [46] Ebenfalls kann die mittels FP-Assay quantifizierte,s uperadditive Bindung und Inhibition von Peptidaldehyden mit Aminen als Bildung solcher Thioaminalprodukte interpretiert werden. [43, 47] Auch die Bildung von Mannich-Basen, als eine spezielle Form stabiler Aminale,sollte durch Proteintemplat-gesteuerte Reaktionen mçglich sein und wird daher momentan von unserer Gruppe näher untersucht. Außer den Aldehyden wurden in weiteren Beispielen für Te mplat-gesteuerte Fragmentligationen auch andere C-Elektrophile verwendet, an die Heteronukleophile addiert werden konnten. Beispielweise gibt es mehrere Berichte zu Thio-Michael-Additionen,b ei denen die Produkte in der Regel gut zu isolieren sind. Jedoch kann hier die Reaktion auch reversibel verlaufen, wenn das Produkt die Retro-Addition über eine b-Eliminierung begünstigt. [46, 117] Alkylierungen sind gewçhnlich komplett irreversibel. In den meisten Fällen wurden zum Erreichen einer mçglichst hohen Reak-tivitätT hiolate als Nukleophile sowie aliphatische Halogenide,E poxide oder Sulfonate als Elektrophile eingesetzt. [118] [119] [120] Diese Arbeiten legen nahe,d ass auch andere C-Elektrophile im Rahmen von Proteintemplat-gesteuerten Reaktionen nützlich sein kçnnten. Beispielweise bieten nukleophile Substitutionen an elektronenarmen Aryleinheiten eine interessante mçgliche Ergänzung zum bestehenden Reaktionsrepertoire. Borsäuren und Boronsäuren wurden ebenfalls als alternative Elektrophile eingesetzt. Mit Diolen als Binukleophile reagieren diese zu Boronatestern als begrenzt stabile Ligationsprodukte. [59, 125] Ein weiteres bekanntes Beispiel fürr eversible Reaktionen, die zu stabilen, isolierbaren Produkten führen, sind die Disulfidbildung und Disulfidaustauschreaktionen. [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] Die letztgenannten Reaktionen nutzen Thiolate als Nukleophil unter leicht basischen, nichtreduzierenden Bedingungen. Über eine ähnliche Austauschreaktion von Thiolaten wurde fürT hioester berichtet. [33, 55, 82, [108] [109] [110] Reaktionen zur Bildung von C-C-Bindungen sind als Te mplat-gesteuerte Reaktionen von besonderem Interesse,d as ie die Auswahl und Diversitätv on zugänglichen Ligationsprodukten enorm erhçhen kçnnten. Bisher sind jedoch nur wenige Beispiele bekannt. In einer Arbeit von Ramstrçm et al. konnte eine reversible,T emplat-gesteuerte Henry-Aldol-Addition von Nitroalkanen mit Aldehyden demonstriert werden. [56] Dabei konnte gezeigt werden, dass der gebildete sekundäre Alkohol mit den besten Bindungseigenschaften im Assay bevorzugt vom verwendeten Zielprotein, einer Lipase, acyliert wurde.O bwohl bisher keine weiteren Verçffentlichungen im Bereich der Templat-gesteuerten Aldol-Reaktionen erschienen sind, sollte sich dieser Reaktionstyp gut für einen Einsatz als Fragmentligationsreaktione ignen, besonders in Anbetracht der detaillierten Literatur über Aldolreaktionen in Wasser und unter milden Reaktionsbedingungen. [56, 111, 116, 128] Ebenfalls konnten Additionen von Cyaniden und Isocyaniden in Wasser demonstriert werden, was vermuten lässt, dass auch die Passerini-und Ugi-Reaktion als Proteintemplat-gesteuerte Reaktionen mçglich sind. Selbiges gilt fürC -C-Knüpfungen mittels Alken-und Alkinmetathesen, deren Anwendung auch in Wasser mçglich war. [112] [113] [114] [115] Klassische Beispiele füri rreversible Te mplat-gesteuerte Reaktionen konnten fürd ipolare Cycloadditionen gezeigt werden, sowohl in Form von Azid-Alkin-Ligationen, die 1,4disubstituierte 1,2,3-Triazole als Reaktionsprodukte liefern, Angewandte Chemie Aufsätze als auch in Form der Sulfonazid-Thiosäure-Ligationen, die Sulfonamide über ein cyclisches Intermediat generieren. [24, 25, 76, [118] [119] [120] [121] [122] [123] [124] Hier ist es offensichtlich, dass zahlreiche andere auf Cycloadditionen basierende Ligationen ebenfalls fürT emplat-gesteuerte Reaktionen eingesetzt werden kçnnten. Über Cycloadditionen hinausgehend wurden irreversible Ligationsreaktionen bislang wenig untersucht, und weitere Ergänzungen sind notwendig, um Ligationsprodukte zu erhalten, die einen grçßeren Te il des biologisch relevanten chemischen Raums abdecken kçnnen. Generell werden für eine erfolgreiche Ligation chemoselektive Reaktionen bençtigt, die in wässriger Lçsung ablaufen. Idealerweise sollte bei der Reaktion ein Linker zwischen den beiden Fragmenten gebildet werden, der die Bindung unterstützt oder sie zumindest nicht behindert. Zum Beispiel ergab eine Strukturanalyse des World Drug Index (einer Datenbank von Molekülen mit erwiesener Bioaktivität) ergab,d ass Amidbindungen besonders häufig als Linker in bioaktiven Verbindungen vorkommen. [129] Daher ist eine Proteintemplat-gesteuerte Amidierungsreaktion von Fragmenten eine besonders nützliche Erweiterung des Reaktionsrepertoires.K ürzlich wurde die erste Proteintemplat-gesteuerte Amidierung ohne Hintergrundreaktion entdeckt. [48] Andere Reaktionstypen, die die Mçglichkeiten von Fragmentligationen erheblich erweitern würden, sind solche,d ie Fragmente verknüpfen kçnnen, ohne dass ein Linker im Produkt zurückbleibt. Dies ist z. B. der Fall bei Kreuzkupplungen sowie Reaktionen, die anstelle einer klassischen Linker-Struktur einen Heterocyclus als Verbindung zweier Fragmente bilden. Nachdem wir Fragmentligationsreaktionen definiert haben und ihren biophysikalischen Hintergrund sowie sinnvolle Detektionsstrategien und zugrundeliegende chemische Tr ansformationen erläutert haben, konzentrieren wir uns nun auf die Anwendung des Konzepts fürd ie Entdeckung und Optimierung von Proteinliganden. Zu Beginn werden wir Arbeiten zu reversiblen Ligationsreaktionen vorstellen, gefolgt von denen zu irreversiblen. Zahlreiche der ersten Anwendungen von reversiblen, Te mplat-gesteuerten Fragmentligationen wurden fürd ynamisch-kombinatorische Bibliotheken (DKBs) gezeigt. Als jüngeres repräsentatives Beispiel fürd iese Methodik wollen wir Arbeiten der Gruppe von Hirsch hervorheben. [36, 98] Als Zielprotein und zugleich Modellenzym füra ndere Aspartatproteasen verwendeten die Autoren Endothiapepsin. Ausn eun Hydraziden (4-12)und einem Bisaldehyd wurde eine dynamische Bibliothek zusammengestellt, die auf zwei zuvor gefundenen Fragment-Hits basierte, [36] die in benachbarte Bindungstaschen des Endothiapepsins binden (Abbildung 9). [98] Um die Analytik zu vereinfachen, wurden zwei Sub-Bibliotheken (DKB-1 und DKB-2) mit vier bzw.f ünf Hydraziden gebildet. Umkehrphasen-HPLC und LC-MS wurden verwendet, um die Templat-gesteuerte Bildung des Bisacylhydrazon-Ligationsprodukts in Gegenwart des Endothiapepsins nachzuweisen. Von den mçglichen 78 Bisacylhydrazonen und zwçlf Monoacylhydrazonen zeigten nur sechs der mçglichen Fragmentkombinationen eine deutliche Verstärkung des HPLC-Signals in Gegenwart des Endothiapepsin-Templats.Z wei der gefundenen Kombinationen, 13 und 16,w urden nachsynthetisiert und in einem Fluoreszenz-basiertenb iochemischen Assay getestet. Beide stellten sich dabei als aktiv heraus,u nd der beste Inhibitor, 13,z eigte eine 240-fache hçhere Potenz als die Ausgangsfragmente,w omit ein erfolgreiches Beispiel einer Drei-Fragmente-Ligation vorgestellt wurde.D iese Arbeit demonstrierte,d ass die Te mplat-gesteuerte Fragmentverknüpfung (im Vergleich zu anderen Methoden fürdie Fragmentoptimierung,z .B.F ragmentvergrçßerung oder Fragmentverschmelzung) besonders fürd ie Identifizierung Abbildung 9. Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligationen unter Anwendung einer dynamischkombinatorischen Bibliothek. [98] A) Isophthalaldehyd und neun Hydrazide 4-12 bilden bis zu 81 Bisacylhydrazone. Bi)Das Modellprotein Endothiapepsin wirkt auf die DKB ein, um so potenzielle Inhibitoren verstärkt zu bilden. Bii) HPLC-Analyse der Templat-gesteuerten und nicht-Templat-gesteuerten Reaktion zeigt deutlich erhçhte Bildung von 13 in Gegenwart des Enzyms. Biii)Bindungsmodi von 19 (violett) und 13 (cyan), aufgeklärt mittels Rçntgenkristallograpie(PDB-IDs:4 KUP bzw. 5HCT). C) Die beste Fragmentkombination 13 zeigt eine 240-fache Erhçhung der Potenz bei gleichzeitig erhçhter Ligandeneffizienz gegenüberj ener des Ausgangsfragments 19. Aufsätze additiver Fragmentkombinationen geeignet ist, in denen die Ligandeneffizienz der kombinierten Fragmente nicht nur beibehalten wird, sondern sich sogar erhçht. Die Schwierigkeit des Ansatzes bestand darin, unter Erhaltung der Bindungsmodi der Fragmente einen geeigneten Linker zu finden, der zusätzliche Wechselwirkungen mit dem Zielprotein ermçglicht. Tr otz dieser positiven Ergebnisse zeigt der Artikel auch die Grenzen von DKB auf,n ämlich die mühsame Analyse von komplexen kombinatorischen Bibliotheken, der hohe Proteinverbrauch und die Beschränkung auf wenige dynamische Reaktionen, die nicht-wirkstoffähnliche Produkte liefern, wie Acylhydrazone. Die gleichen Grenzen werden durch Claridge et al. verdeutlicht, die im Zuge eines DKB-Experiments 11 B-NMR-Spektroskopie zur Detektion von Serinprotease-Inhibitoren einsetzten. [59] Zur Entwicklung der Methode verwendeten sie a-Chymotrypsin (aCT) als Modellenzym und untersuchten die Ligation von Boronsäuren mit Zuckern, um verbesserte Enzyminhibitoren zu bilden. Die Bildung der tertiären Komplexe aus Enzym, Boronsäure und Zuckerdiol wurde mittels 11 B-NMR-und 1 H-WaterLOGSY-NMR-Spektroskopie (WaterLOGSY = Water-Ligand Observed via Gradient SpectroscopY) analysiert. Diese Ergebnisse spornten die Gruppen von Schofield und Claridge dazu an, native Massenspektrometrie einzusetzen, um Hits aus einer DKB zu identifizieren. Reversibel gebildete Boronatester wurden als Inhibitoren der Prolyl-Hydroxylase-Domäne 2( PHD2) identifiziert, eines Enzyms aus der Familie der 2-Oxoglutarat(2OG)-abhängigen Oxygenasen (Abbildung 10). [130] PHD2 ist eine Fe II -haltige 2-OG-Oxygenase,d ie eine Rolle bei der Regulation der menschlichen Hypoxie-Antwort spielt, und ist damit ein geeignetes Zielprotein zur Behandlung von anämischen und ischämischen Krankheitsbildern. In den Experimenten wurde ein heterocyclisches,F e IIbindendes Boronsäurefragment mit mehreren Gruppen von Diol-Liganden inkubiert und im Anschluss mittels nativer MS analysiert. Die am besten bindenden Fragmentkombinationen wurden durch eine Zunahme der Proteinmasse identifiziert und anschließend über eine Suzuki-Kreuzkupplung in stabile,B or-freie Inhibitoren überführt, die Aktivitäten bis hinab in den nanomolaren Bereich aufwiesen. Die Ergebnisse des Fragmentligationsassays konnten in einer Folgestudie mit einer 1 H-NMR-basierten Methode bestätigt werden. [131] Der "tethering approach" ist ein klassisches Beispiel für reversible,T emplat-gesteuerte Fragmentligationen unter Anwendung von Disulfid-Austauschreaktionen. [132] Die Methode nutzt die auf der Proteinoberfläche stattfindende,r eversible Disulfid-Austauschreaktion zwischen natürlichen oder künstlich eingefügten Cysteinresten und einem Disulfidhaltigen, niedermolekularen Fragment in Lçsung.I ne iner Weiterentwicklung der Methode wurden durch die Gruppe von Erlanson so genannte Extender, also Erweiterungsgruppen, eingeführt, was nochmals zu einer deutlichen Ausdehnung der Einsatzmçglichkeiten im Rahmen von Fragmentligationen führte. [133] 2008 berichtete die Gruppe über ein Inhibitor-Screening mit der Aurorakinase als Zielprotein (Abbildung 11). [134] Der erste Schritt bestand darin, einen Cysteinrest in der Nähe der ATP-Bindungsstelle einzuführen. Als Nächstes wurde ein dynamischer Extender synthetisiert, der aus zwei Disulfidresten und einem Diaminopyridin be-Abbildung 10. A) Bildung von Boronsäure/Boronatsäureester-Leitstrukturen innerhalb einer dynamisch-kombinatorischen Bibliothek aus Diolen und Boronsäuren in Gegenwart des Proteintemplats PDH2. [130] B) Identifizierung von potenten Boronatester-Konjugatenm ittels Boronsäure-"Gerüstliganden" führt zur Entdeckungd er ersten und zweiten Generation von stabilen Analoga, die PHD2-Aktivitätbis hinab in den nanomolaren Bereich zeigen. Aufsätze stand, das ein bekannter Ligand der Purinbindungsstelle ist. Einer der Disulfidreste konnte an der eingeführten Cysteinseitengruppe angreifen, der andere konnte ein sekundäres Disulfidfragment binden. Sobald dieses sekundäre Fragment mit der adaptiven Region des Proteins in der Nähe des Extenders wechselwirkte,w urde eine thermodynamisch stabilisierte Disulfidbindung gebildet. Dieser stabilisierte Komplex konnte anschließend durch die Veränderung der Proteinmasse per Massenspektrometrie detektiert werden. Es wurde eine Bibliothek mit ca. 4500 Disulfidfragmenten in Gruppen von jeweils zehn Fragmenten durchmustert, was zur Identifizierung mehrerer Fragmentkombinationenf ührte.G eringfügige Modifikationen der jeweiligen Fragmente resultierten in der Bildung eines stabilen Inhibitors mit Affinitäti mm ikromolaren Bereich. Ein ähnlicher Ansatz wurde bei einer anderen Kinase,d er Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase-Isozym 1(PDK1), eingesetzt. Der Extender wurde in diesem Fall jedoch über eine irreversible Alkylierung am Zielprotein befestigt. [135] Dynamisches Ligationsscreening wurde 2008 eingeführt, um die Detektionsgrenzen und Einschränkungen von kombinatorischen Methoden wie DKB zu überwinden. Die erste Bioaktivitäts-basierte Detektion von reversibel gebildeten Fragmentligationen konnte an der SARS-Coronavirus-Hauptprotease (SARS CoV M pro )g ezeigt werden (Abbildung 12). [43] SARS CoV M pro ist eine vom Virus kodierte Cysteinprotease,d ie essenziell fürd ie Virusreplikation innerhalb der infizierten Wirtzellen ist und deren Inhibitoren sich daher zum Einsatz als mçgliche Virustatika eignen. [136, 137] Da die Protease definierte Bindungstaschen zur Unterbringung von Peptidseitenketten enthält, war es mçglich, einen Peptidaldehydinhibitor zu entwickeln, der seine elektrophile Aldehydgruppe direkt am aktiven Zentrum der Protease positioniert. Durch Dynamisches Ligations-Screening einer Fragmentbibliothek von 234 Nukleophilen konnten einige Fragment-Hits identifiziert werden, die in der S1'-Bindungstasche binden und K I -Werte im millimolaren Bereich aufweisen konnten. Der beste Fragment-Hit wurde anschließend in ein entsprechendes Aldehydfragment umgewandelt und einem weiteren Screening mit einer Aminbibliothek unterzogen. Dies führte zur Entdeckung eines sekundären Hit-Fragments,das in der S1-Bindungstasche des Enzyms bindet. Lediglich zwei Durchläufe eines dynamischen Ligations-Screenings,a usgehend von einem peptidischen Inhibitor, führten zur Selektion von zwei millimolar aktiven, niedermolekularen Fragmenten, deren kovalente Verknüpfung durch reduktive Aminierung zu einem komplett nichtpeptidischen Inhibitor der SARS CoV M pro mit einem K I -Wert von 2.9 mm führte. Weitere Beispiele von Bioaktivitäts-basierten, dynamischen Ligationsassays sind in Tabelle 2z usammengefasst. Caspase 3s pielt eine entscheidende Rolle bei der Steuerung der Apoptose von Zellen und ist damit ein mçgliches Zielprotein fürMedikamente zur Behandlung von traumatischen Hirnverletzungen, amyotropher Lateralsklerose sowie der Alzheimer-und Parkinson-Krankheit. Das Protein wurde mit einem nanomolaren Fluorophor-markierten Peptidylketoaldehyd und insgesamt 7397 Fragmenten getestet, einschließlich 4019 nukleophiler,p rimärer Amine.D as Screening wurde mithilfe eines Fluoreszenzpolarisations-Bindungsassays in Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen durchgeführt. Dabei konnte fürd ie meisten getesteten Fragmente keine ¾nderung des FP-Signals festgestellt werden. 78 Fragmente zeigten jedoch ein gegenüber der Kontrollmessung reduziertes Signal (negative Kooperativität), und bei 176 Fragmenten konnte ein signifikant erhçhtes FP-Signal (positive Kooperativität) erhalten werden. 21 Fragmente konnten dabei als kompetitive Inhibitoren von Caspase 3m it K I -Werten von < 10 mm bestätigt werden. Das beste kooperativ bindende Fragment, B,w urde durch reduktive Aminierung kovalent mit Fragment A verknüpft und lieferte einen potenten Caspase-3-Inhibitor mit einem K I -Wert von 80 pM. Dynamische Ligationsassays wurden darüber hinaus für das Screening der sekundären Bindungsstellen von vier nahe verwandten Proteintyrosin-Phosphatasen (PTPs) eingesetzt: von menschlicher PTP1B,P TPN7, PTPN12 (= SHP2) und mykobakterieller MPTPA. [45] Generell gilt die Entwicklung von spezifischen PTP-Inhibitoren als anspruchsvolle Aufgabe,u nd es wird bezweifelt, ob sich diese physiologisch so relevante Enzymklasse überhaupt als Zielprotein fürn eue Wirkstoffe eignet. Unter Verwendung von 4-Formylphenylphosphat als elektrophilem PTP-Substrat und einer kleinen, aus 110 primären Aminen bestehenden Fragmentbibliothek konnten jedoch spezifische Fragmente fürs ekundäre Bindungsstellen jedes der getesteten PTPs gefunden werden. Die spezifischen Fragmente der PTPs wurden durch einen Substratverstärkungsassay detektiert (Abbildung 7B): Aktive Fragmente bilden dabei ein Ligationsprodukt mit dem PTP-Substrat, was zu einer erhçhten Stabilitätd es Enzym-Substrat-Komplexes führt und damit einen herabgesetzten K M -Wert zur Folge hat. Die durch das Sekundärfragment verbesserte Substraterkennunng führte zu einer verstärkten Freisetzung von Phosphationen, die anschließend in einem Malachitgrünassay quantifiziert werden konnten. Durch Austausch des Phenylphosphats gegen ein nichtspaltbares Phosphotyrosin-Mimetikum und anschließende kovalente Verknüpfung mit dem gefundenen MPTPA-spezifischen Aminfragment konnten Inhibitoren der Protein-Tyrosin-Phosphatase Aa us Mycobacterium tuberculosis (MPTPA) gefunden werden, die keine Aktivitätgegen die drei anderen PTPs aufwiesen. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Adressierung der sekundären Bindungsstellen der PTPs mit spezifischen Fragmenten die Entwicklung von selektiven PTP-Inhibitoren ermçglicht. Das dynamische Ligations-Screening konnte auch auf Aspartylproteasen ausgeweitet werden, wobei hier ein FRET-Assay verwendet wurde. [44] Ein Peptidaldehyd wurde als dirigierende Sonde eingesetzt, um Fragmente zu identifizieren, die im aktiven Zentrum der Aspartylprotease-b-Sekretase (BACE-1) binden. Dieses Enzym wurde als Hauptursache fürd ie vermehrte Ablagerung von Amyloid-b-Peptiden identifiziert, eines der wichtigsten pathologischen Merkmale der Alzheimer-Krankheit. Daher gab es erhebliche Bemühungen, BACE-1-Inhibitoren füre ine mçgliche Behandlung der Alzheimer-Krankheit zu entwickeln. Anstelle der reversiblen Halbthioacetalbildung wurde in diesem Fall die Hydratform des Aldehyds gebildet, die über Wasserstoffbrücken dazu in der Lage ist, die Aspartatreste der katalytischen Diade zu binden. Durch dynamische Ligation des Peptidaldehyds mit einem Aminnukleophil konnten so reversibel Iminprodukte gebildet werden. Der Peptidaldehyd, der als kovalenter,c hemisch reaktiver Inhibitor (CRI) wirkte,o ffenbarte 3- Bioaktivitäts-basierten Detektion wurde kürzlich fürd ie Aspartylprotease Endothiapepsin berichtet. [64] In der jüngsten Arbeit konnten reversible Proteintemplatgesteuerte Fragmentligationen auf die Entdeckung von irreversiblen Inhibitoren der enteroviralen Proteasen ausgeweitet werden (Abbildung 13). [85] Dabei wurde Epoxyaldehyd 23, der eine modifizierte Partialstruktur des bekannten Cysteinproteaseinhibitors E-64 darstellt, als ein schwacher, irreversibler Inhibitor der 3C-Protease des Coxsackie-3B-Virus mit einer Bibliothek von 850 primären Aminfragmenten getestet. 5-Aminopyrazolon 24 wurde als Fragment-Hit entdeckt, der in Kombination mit dem Epoxyaldehyd zu einer superadditiven Inhibition sowie zur kovalenten Modifizierung der Protease führte.M ehrfache Optimierung des Ligationsprodukts von 23 und 24 führte schließlich zu im sub-mikromolaren Bereich aktiven Breitbandinhibitoren enteroviraler Proteasen, die zu einer 300-bis 500-fachen Beschleunigung der Desaktivierung des Proteins führen, ohne dass signifikante Kreuzreaktivitäten mit nichtviralen Proteasen beobachtet wurden. Im Bereich der irreversiblen Proteintemplat-gesteuerten Fragmentligationen wurden erste Studien durch die Gruppe von Sharpless durchgeführt und als "target-guided synthesis" bezeichnet. Die Autoren nutzten die dipolare Cycloaddition von Aziden und Alkinen fürI n-situ-Klick-Reaktionen, die Te mplat-gesteuert durch das Protein Acetylcholinesterase (AChE) waren. [30] AChE ist ein Zielprotein bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit. In einer Folgearbeit aus dem Jahr 2005 wurde die Methode erneut am gleichen Zielprotein angewendet, um eine Fragmentkombination zu finden, die sowohl das aktive Zentrum als auch eine periphere Bindungsstelle besetzt (Abbildung 14). [123] Als Startpunkt wurde der etablierte,imaktiven Zentrum des Enzyms bindende AChE-Inhibitor Tacrin verwendet. In die Struktur von Tacrin wurde zunächst eine Azidgruppe eingeführt. Anschließend wurde eine Auswahl von 23 terminalen, an der peripheren Bindungsstelle bindenden Alkinfragmenten auf die Entstehung von 1,2,3-Triazolprodukten über dipolare Cycloaddition getestet. Erste LC-MS-Messungen konnten den Te mplateffekt des Proteins auf die Ligation [a] Werte entsprechen,w enn nicht anders angegeben, den ermittelten K I -Werten. Aufsätze der gebundenen Fragmente bestätigen. Nur in Gegenwart des Proteins wurden 1,5-disubstituierte (syn-)Triazole gebildet, und dies mit nur geringer oder gar nicht vorhandener Hintergrundreaktion. Nachdem die Reaktion von einzelnen Fragmentpaaren hatte bestätigt werden kçnnen, wurden im Anschluss Gemische von bis zu zehn Alkinen gleichzeitig getestet. Tatsächlich konnte auch hier das Proteintemplat die Bildung von hochpotenten Fragmentkombinationen induzieren, die Dissoziationskonstanten im niedrigen pikomolaren oder sogar im femtomolaren Bereich aufweisen konnten. Azid-Alkin-Ligationen wurden auch auf andere Zielproteine angewendet. [76, [121] [122] [123] [124] [125] 138] So ließ sich z. B. die Bildung eines bekannten, nanomolar aktiven HIV-Protease-Inhibitors mit anti-substituierter 1,2,3-Triazolstruktur in Gegenwart des Enzyms beschleunigen. [138] In diesem Fall lief die Reaktion gegenüber der Bildung der piko-oder femtomolaren AChE-Inhibitoren erheblich langsamer ab,u nd es wurde auch eine deutliche Hintergrundreaktion zum syn-Triazol beobachtet. Proteintemplat-gesteuerte Azid-Alkin-Klick-Reaktionen wurden auch fürd ie Ty rosinkinase ABL1 demonstriert. [121] Fukase et al. zeigten die Templat-gesteuerte Bildung von funktionsfähigen Mimetika der Grb2-SH2-Domäne,d ie in vitro das Wachstum von Krebszellen hemmten. [76] Um den besten Inhibitor mittels Te mplat-gesteuerter Ligation von Azid-und Alkinfragmenten zu erhalten, ist es essenziell, dass die Reaktion unter vollständiger Abwesenheit von Kupferionen abläuft. Die Gruppen von Miyata und Finn berichteten von einer In-situ-Synthese eines Inhibitors der Histon-Desacetylase 8( HDAC-8) ausgehend von einem Alkinfragment, das eine Hydroxamsäurestruktur enthält, und einem Azidfragment. [122] Überraschenderweise wurde hierbei jedoch bei weitem nicht der beste Inhibitor gebildet, sondern ein gegenüber dem syn-Triazol weniger aktives,1,4-disubstituiertes anti-Triazol. Eine gründliche Untersuchung dieser Befunde Abbildung 13. Entdeckungvon irreversiblen Inhibitorend er Coxsackie-Virus-B3-3C-Protease durch Anwendung von reversiblen Proteintemplat-gesteuerten Fragmentligationen. [85] Das nukleophile Amin-Fragment 24 bindet in der S1-Tasche des Enzyms (A) und bildet mit dem bi-elektrophilen Warhead 23 ein reversibles Fragmentligationsprodukt (B). Anschließendw ird das Epoxid durch Angriff der Cysteinseitenkette im aktiven Zentrum gespalten, was mittels LC-MS nachgewiesen werden konnte (C). Das Ligationsprodukt zeigt im FRET-Assay einen stark überadditiven inhibitorischen Effekt und wurde daraufhin zu einem potenten Breitspektruminhibitor von enteroviralen und rhinoviralen 3C-Proteasen optimiert. Abbildung 14. Entwicklung von AChE-Inhibitoren durch Proteintemplatgesteuerte Fragmentligation. [123] Der AChE-Inhibitor Tacrin wurde durch Einführungeiner Azidgruppe modifiziert und fungiert so als Verankerungsmoleküli maktiven Zentrum des Proteins.G ruppen verschiedener Alkine wurden zugegeben, und mittels Templat-gesteuerter Reaktion konnten zwei hochpotente syn-1,2,3-Triazole erhalten werden. ergab,d ass der Reaktionsansatz Spuren von Cu I -Ionen enthielt, die an der Metallbindungsstelle von HDAC-8 gebunden waren und dafüra usreichten, die Reaktion zum weniger bevorzugten Cycloadditionsprodukt zu katalysieren. Über Azid-Alkin-Ligationen hinaus wurden auch andere dipolare Cycloadditionen untersucht. Reaktionen von Thiosäuren mit Sulfonazidfragmenten, die über einen cyclischen Übergangszustand Acylsulfonamide generieren, liefern besonders gelungene Beispiele und wurden als Sulfo-Klick-Reaktionen bezeichnet. 2011 konnten Manetsch et al. diese Reaktion in Form einer Proteintemplat-gesteuerten, irreversiblen Ligation an einem besonders anspruchsvollen Ziel demonstrieren:der PPI-Domäne des Bcl-X L -Proteins. [120] Die Interaktion von Bcl-X L mit dem BH3-Peptid ist ein entscheidender Schritt in der Regulation des programmierten Zelltods (Apoptose Der Inhibitor zeigte eine bemerkenswerte superadditive Erhçhung seiner freien Bindungsenergie (der K I -Wert betrug 29 nm anstelle der erwarteten 3 mm fürden additiven Fall), die aus der durch die Fragmentverknüpfung relativ erniedrigten Abbildung 15. Templat-gesteuerte Bildung des Sulfonamid-Bcl-X L -Inhibitors SZ7TA2 ausgehend vom Sulfonazidfragment SZ7 und Thiosäurefragment TA2. [119] A) Chemischsynthetisierte Referenzverbindung. B) Templat-gesteuerte Reaktion:F ragmente wurden in Gegenwart des Zielproteins inkubiert;B cl-X L wirkt als Templat fürdie Bildung von SZ7TA2. C) Hintergrundreaktion:F ragmente wurden ohne Bcl-X L inkubiert; lediglich geringe Mengen des Produkts entstehen. D) Blockierung der Bcl-X L -Bindungsstelle durch das Bim-BH3-Peptid führt zur Unterdrückung der Produktbildung. E) Mutiertes Bim-BH3-Peptid hat nur geringe AffinitätzuBcl-X L und führt daher nicht zur Unterdrückung der Templat-gesteuerten Fragmentligation. Bindungsentropie resultierte.Der Protein-Inhibitor-Komplex wurde kristallisiert, und die erhaltene hochaufgelçste Struktur ermçglichte es den Autoren, die Te mplat-gesteuerte Amidierung im sterischen und mechanistischen Detail zu erklären. Zukunft der Proteintemplat-gesteuerten Fragmentligation Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligationen wurden in den letzten Jahren als alternativer und ergänzender Zugang zu bioaktiven Proteinliganden etabliert. Hinsichtlich einiger Aspekte konnten dabei bedeutende Fortschritte erzielt werden. Verbesserte und spezialisierte analytische und bioanalytische Methoden haben zu einer breiten Anwendung und einem tieferen Verständnis der Methode beigetragen. Die Auswahl an mçglichen Ligationsreaktionen wurde kontinuierlich erweitert, und weitere Ergänzungen zu den Reaktionen, die Te mplat-gesteuert Fragmentligationsprodukte liefern, sind zu erwarten. Nachdem nun der biophysikalische Hintergrund, die zugrundeliegende Chemie und tatsächlichen Anwendungen der Methode besprochen wurden, sind wir dazu in der Lage,d ie Stärken und Grenzen der Methode zu erçrtern. Schließlich werden wir einen Ausblick auf die zukünftigen Mçglichkeiten und voraussichtlichen Entwicklungen dieser Te chnik als Teil des Prozesses der Wirkstofffindung geben. Der grçßte Vorteil der Proteintemplat-gesteuerten Fragmentligationen gegenüber anderen Fragment-basierten Methoden ist zweifelsohne die Mçglichkeit, ortsgerichtet und mit präziser räumlicher Auflçsung Fragmente zu identifizieren, die in einer genau definierten Bindungstasche des Proteins binden. Zwar ist es auch mit anderen Fragment-basierten Methoden, z. B. durch den Einsatz der Rçntgenkristallographie oder bestimmter NMR-basierter Methoden, mçglich, Strukturinformationen zur Bindung eines Liganden zu er-halten, jedoch kann keine dieser Methoden dazu verwendet werden, Fragmentassays durchzuführen, die spezifisch auf eine Bindungsstelle ausgerichtet sind. Die ortsgerichtete Fragmentdetektion wird dabei durch die Struktur und die so definierte Bindungsstelle des reaktiven Startfragments ermçglicht. Der zweite große Vorteil Proteintemplat-gesteuerter Fragmentligationsassays ist ihre Empfindlichkeit, die durch die (super-)additive Bindungsverstärkung von kovalent verknüpften Fragmenten bedingt ist. Als Resultat davon kçnnen durch Fragmentligationsassays Fragmente identifiziert werden, die mit anderen Fragment-basierten Methoden zur Wirkstofffindung nicht oder nur bei sehr viel hçheren Fragment-oder Proteinkonzentrationen detektierbar sind. Ausd iesem Grund kann die Methode Proteinliganden mit alternativen Strukturen und erhçhter Ligandeneffizienz liefern. Ein dritter Vorteil liegt in den praktischen und wirtschaftlichen Vorzügen des Verfahrens,b edingt durch die Integration von Synthese der Fragmentkombinationen und Detektion der Bioaktivitätineinem Schritt. Dies führt dazu, dass der Aufwand und die Ressourcen fürd ie chemische Synthese bioaktiver Liganden erheblich reduziert werden, da lediglich die bioaktiven Fragmentkombinationen zur weiteren strukturellen und funktionellen Va lidierung nachsynthetisiert werden müssen. Während im klassischen Hochdurchsatz-Screening riesige Bibliotheken von Wirkstoff-ähnlichen Molekülen eingesetzt werden, um den chemischen Raum adäquat abzudecken, sind bei Fragmentligations-Screenings kleine Bibliotheken reaktiver Fragmente ausreichend, um den chemischen Raum aller mçglichen Fragmentkombinationen zu durchmustern. Eine generelle Voraussetzung der Fragmentligationsassays ist, dass ein reaktives Startfragment vorhanden sein muss. Diese Forderung kann problematisch sein, falls es keinen geeigneten, bereits bekannten Liganden des Zielproteins gibt. In solchen Fällen sind komplementäre Methoden, wie klassisches Screening oder Struktur-basiertes Design, unerlässlich, um einen Ausgangspunkt fürdie Fragmentligation zu finden. Abbildung 16. Proteintemplat-gesteuerte Amidierung des Aktivesters 39/40 mit 4-Aminomethylbenzamidin (41)führte zur Bildung des nanomolaren Faktor-Xa-Inhibitors. [47] Die Proteintemplat-gesteuerte, hintergrundfreie Reaktionw urde mithilfe eines Bioaktivitäts-basierten Assays gezeigt und die auto-inhibitorische Kinetik der Inhibitorbildung durch QTOF-MSnachgewiesen. Die Kristallstruktur des Protein-Inhibitor-Komplexes ermçglichte es, den sterischen Verlauf der Templat-gesteuerten Reaktion zu erklären. Eine weitere Voraussetzung fürP roteintemplat-gesteuerte Fragmentligationsassays ist, dass eine Ligationsreaktion verfügbar sein muss,d ie den relevanten chemischen Raum abdeckt und zugleich kompatibel mit den verwendeten Assaybedingungen ist. Wiei nd en Abschnitten 4u nd 5g ezeigt wurde,steigt die Zahl der Reaktionen, die zur Anwendung im Rahmen eines Fragmentligationsassays angepasst werden konnten, stetig an, jedoch ist hier weitere Forschung nçtig,um weitere der privilegierten Wirkstoff-artigen Fragmentverknüpfungen durch Ligationsassays zugänglich zu machen. Insbesondere Reaktionen zur Bildung von C-C-Bindungen, Heterocyclen und direkten Verknüpfungen zwischen cyclischen Fragmenten, die häufig über Kreuzkupplungen entstehen, sollten verstärkt untersucht werden. Die kritische Evaluierung zeigt, dass Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligationen bereits heute als eine vielseitig einsetzbare Methode betrachtet werden kçnnen, die zum modernen Wirkstofffindungsprozess beitragen und die anderen etablierten und erfolgreichen Methoden ergänzen sollte.D ies ist besonders der Fall, wenn die spezifischen Vorzüge der Methode gefragt sind:räumlich aufgelçstes und gerichtetes Screening sowie hohe Empfindlichkeit fürd ie Identifizierung neuer Fragmente und die chemische Weiterentwicklung von bekannten Proteinliganden. Die zukünftige Forschung wird zeigen, ob es die spezifischen Vorteile der Methode ermçglichen werden, klinische Kandidaten mit verbesserten Eigenschaften hervorzubringen. Letzten Endes wird die Bedeutung der Proteintemplat-gesteuerten Fragmentligationen davon abhängen, in welchem Maße die Methode dazu in der Lage ist, zur großen Verheißung der Fragment-basierten Wirkstofffindung beizutragen: bessere Wirkstoffe mit hoher Potenz, Spezifitätsowie weniger Zielprotein-unabhängigen Nebenwirkungen zu finden. Wahrscheinlich werden Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligationen in enger Zusammenarbeit mit anderen Fragment-basierten Methoden sowie der klassischen Leitstruktursuche ihren Beitrag zum Erreichen dieses Ziels leisten kçnnen. Über den praktischen Erfolg der Methode im Prozess der Wirkstofffindung hinaus liefern Proteintemplat-gesteuerte Fragmentligationen jedoch auch leistungsfähige und überaus attraktive Forschungs-und Lehrbeispiele,d ie uns beibringen, wie Te ilstrukturen eines Moleküls additiv wechselwirken, um so hochaffine Proteinliganden bilden zu kçnnen. Damit hilft uns die Methode zu verstehen, wie molekulare Erkennung die Moleküle des Lebens funktionieren lässt und wie molekulare Evolution ablaufen kann. Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte vorliegen. Rademann in Fragment-based Drug Discovery Lessons and Outlook (Hrsg Proc.N atl. Acad. Sci Proc. Natl. Acad. Sci Proc.N atl. Acad. Sci Proc.N atl. Acad. Sci Proc.N atl. Acad. Sci Expert Opin. Drug Discovery Angew.C hem. Int Angew.C hem. Int Drug Discovery Today Sanders in Dynamic Combinatorial Chemistry (Hrsg Drug Discovery Today Dynamic Combinatorial Chemistry in Drug Discovery,B ioorganic Chemistry,a nd Materials Science (Hrsg.: B. L. Miller),W iley,H oboken Proc.Natl. Acad. Sci Proc. Natl. Acad. Sci Manuskripte rhalten: 23 Veränderte Fassung erhalten: 10 Akzeptierte Fassung online: 24 Endgültige Fassung online: 31