key: cord-0737033-flwc0w88 authors: Murillo, Enderson; Rua, Katherine Palacio; Ayala, Carlos Afanador; Correa, Juan Felipe García; Zuluaga, Andrés F title: Validación de una nueva estrategia para la identificación de variantes de SARS-CoV-2 mediante secuenciación del gen Espiga por Sanger date: 2022-05-16 journal: Enferm Infecc Microbiol Clin DOI: 10.1016/j.eimc.2022.04.014 sha: 48c6b3715a717d1bfafa7bfe77b12c80c861783d doc_id: 737033 cord_uid: flwc0w88 Introducción: La aparición de múltiples variantes del SARS-CoV-2 durante la pandemia de COVID-19 es motivo de gran preocupación mundial. Hasta el momento, su análisis se ha centrado principalmente en la secuenciación de nueva generación (NGS). Sin embargo, esta técnica es costosa y requiere equipos sofisticados, largos tiempos de procesamiento y personal técnico altamente cualificado con experiencia en bioinformática. Para contribuir al análisis de variantes de interés y de preocupación, aumentar la capacidad diagnóstica y procesar muestras para realizar vigilancia genómica, proponemos una metodología rápida y fácil de aplicar, basada en la secuenciación Sanger del gen que codifica para la proteína Espiga. Métodos: Se secuenciaron 15 muestras positivas para SARS-CoV-2 con Ct<25 por metodologías Sanger y NGS. Los datos obtenidos fueron analizados en las plataformas Nextstrain y PANGO Lineages. Resultados: Ambas metodologías permitieron identificar las variantes de interés reportadas por la OMS. Se identificaron dos muestras como alfa, tres Gamma, una Delta, tres Mu, una Omicron y cinco cepas cercanas al aislado inicial del virus Wuhan-Hu-1. Según el análisis in silico, también se pueden detectar mutaciones clave para identificar y clasificar otras variantes no evaluadas en el estudio. Conclusión: Los diferentes linajes de interés y preocupación de SARS-CoV-2 se clasifican de forma rápida, ágil y fiable con la metodología de secuenciación de Sanger. [[[en]]]ABSTRACT Introduction: The emergence of multiple variants of SARS-CoV-2 during the COVID-19 pandemic is of great world concern. Until now, their analysis has mainly focused on next-generation sequencing (NGS). However, this technique is expensive and requires sophisticated equipment, long processing times, and highly qualified technical personnel with experience in bioinformatics. To contribute to the analysis of variants of interest and variants of concern, increase the diagnostic capacity, and process samples to carry out genomic surveillance, we propose a quick and easy methodology to apply, based on Sanger sequencing of three gene fragments that code for protein Spike. Methods: Fifteen positive samples for SARS-CoV-2 with Ct<25 were sequenced by Sanger and NGS methodologies. The data obtained were analyzed on the Nextstrain and PANGO Lineages platforms. Results: Both methodologies allowed the identification of the variants of interest reported by the WHO. Two samples were identified as Alpha, three Gamma, one Delta, three Mu, one Omicron, and five strains were close to the initial Wuhan-Hu-1 virus isolate. According to in silico analysis, key mutations can also be detected to identify and classify other variants not evaluated in the study. Conclusion: The different SARS-CoV-2 lineages of interest and concern are classified quickly, agilely, and reliably with the Sanger sequencing methodology. J o u r n a l P r e -p r o o f 5 variantes presentan mutaciones en el gen de la proteína S 4 , por lo tanto, la mayoría de 96 las estrategias terapéuticas y el desarrollo de vacunas se han centrado en este gen. 97 La detección de las diferentes mutaciones y la tipificación de las variantes se realiza por datos, son similares a lo recomendado en otras investigaciones 13, 15 . El protocolo se 264 probó con muestras extraídas por métodos automatizados de perlas magnéticas y 265 extracciones con columnas con sílica generando buen resultado, especialmente con la 266 metodología de columnas. Aunque no se encontraron todas las variantes de SARS-CoV-2 en las muestras clínicas, 268 el análisis in silico de la proteína S, demostró que esta metodología asegura la detección y S:N501. Estas mutaciones son de gran importancia, debido a que la OMS y el CDC de 271 EE.UU los definió como mutaciones clave presentes en VOI y VOC con fines de vigilancia 272 genómica 13 . La mutación S:D614G se encontró en todas las muestras analizadas, es llamada la 274 mutación universal y se considera que todas las VOI y VOC derivan de esta mutación 16 . En conclusión, esta metodología permite la detección de mutaciones en la proteína S de 338 forma ágil y precisa, rápida y con infraestructura disponible en los laboratorios clínicos, 339 de salud pública y de investigación en Colombia que sirven como apoyo a la red de 340 diagnóstico y vigilancia genómica del virus SARS-CoV 2. Simulación in silico de la cobertura del gen S por los cebadores LIME. Los productos generados cubren la mayoría de las mutaciones y deleciones asociadas con VOI y VOC. B. Deleción H69/V70 frecuente en la variante Alpha. C. Mutaciones puntuales y deleciones entre los aminoácidos 148, 150 y 160 de la proteína S, se destaca la deleción E156/F157 identificada en la variante Delta. D. Mutación D614G presente en todas las muestras evaluadas. E. Inserción 214EPE característica de la variante Omicron 21K (BA.1). Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19 Rapid screening for SARS-CoV-2 variants of concern in clinical and environmental samples using nested RT-PCR assays targeting key mutations of the spike protein A simple and fast method to sequence the full-length spike gene for SARS-CoV-2 variant identification from patient samples Two-step strategy for the identification of SARS-CoV-2 variant of concern 202012/01 and other variants with spike deletion H69-V70 Tracking changes in SARS-CoV-2 spike: evidence that D614G increases infectivity of the COVID-19 virus Increased mortality in community-tested cases of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7 Global initiative on sharing all influenza data -from vision to reality Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution A rapid, cost efficient and simple method to identify current SARS-CoV-2 variants of concern by Sanger sequencing part of the spike protein gene Validación de una técnica de PCR dúplex usando el gen E Lineamientos para la gestión de muestras durante la pandemia del SARS-CoV-2 (COVID-19) en Colombia A routine Sanger sequencing target specific mutation assay for SARS-CoV-2 variants of concern and interest A Sanger-based approach for scaling up screening of SARS-CoV-2 variants of interest and concern Evaluating the effects of SARS-CoV-2 spike mutation D614G on transmissibility and pathogenicity Covariants: SARS-CoV-2 mutations and variants of interest Mutations and phylogenetic analyses of SARS-CoV-2 among imported COVID-19 from abroad in Nanjing The spike D614G mutation increases SARS-CoV-2 infection of multiple human cell types A SARS-CoV-2 mutant from B.1.258 lineage with ∆H69/∆V70 deletion in the spike 60 SARS-CoV-2 variant Delta rapidly displaced variant Alpha in the United States and led to higher viral loads The unique evolutionary dynamics of the SARS-CoV-2 Delta variant Israel Consortium of SARS-CoV-2 sequencing Rapid epidemic expansion of the SARS-CoV-2 Omicron variant in southern Africa Genomic perspectives on the emerging SARS-CoV-2 Omicron variant Neutralization against Omicron SARS-CoV-2 from previous non-Omicron infection PCR assay to enhance global surveillance for SARS-CoV-2 variants of concern A rapid and low-cost protocol for the detection of B.1.1.7 lineage of SARS-CoV-2 by using SYBR Green-based RT-qPCR Quantitative detection of SARS-CoV-2 Omicron variant in wastewater through allele-specific RT-qPCR. medRxiv Development of an efficient Sanger sequencing-based assay for detecting SARS-CoV-2 spike mutations Genomic surveillance of SARS-CoV-2 spike gene by sanger sequencing Mass screening of SARS-CoV-2 variants using Sanger sequencing strategy in