key: cord-0708987-ibxmf2pr
authors: Elter, Adrian; Bogen, Jan P.; Habermann, Jan; Kolmar, Harald
title: Vom Huhn abgeleitete Antikörper für Diagnostik und Immuntherapie
date: 2021-09-04
journal: Biospektrum (Heidelb)
DOI: 10.1007/s12268-021-1623-3
sha: e661215562a8299be621a67cfd15f5753c021b58
doc_id: 708987
cord_uid: ibxmf2pr

Due to the large evolutionary distance between birds (Aves) und humans, immunization of chickens with human proteins results in a strong response of the bird’s adaptive immune system to proteins of mammalian origin. Additionally, chicken-derived antibodies display less undesired cross-reactivity in analytical setups than conventional rodent-derived antibodies. Due to these features as well as the facile amplification of antibody-coding genes, chicken-derived antibodies emerged as promising molecules for the immunotherapy and various biotechnological applications.

BIOspektrum | 05.21 | 27. Jahrgang ó In den letzten Monaten wird die Gewinnung von Antikörpern durch die Immunisierung von Versuchstieren sehr kontrovers diskutiert. Einige Forschende plädieren für die tierfreie Gewinnung monoklonaler Antikörper ausschließlich aus Masterbibliotheken, die aus dem Blut nicht immunisierter Spender gewonnen und mit speziellen molekularbiologischen Methoden wie Phagen-Display nach Antikörpern mit gewünschten Eigenschaften durchmustert werden [1] . Solche Ansätze erfordern den Einsatz sehr großer Bibliotheken mit mehreren Milliarden Varianten. Es braucht viel Erfahrung in der Handhabung und der Isolierung von Klonvarianten mit gewünschten Bindeeigenschaften. Diese Verfahren bleiben daher auf wenige spezialisierte Labore oder Biotechunternehmen, die die Antikörperisolierung als bezahlten Service anbieten, beschränkt [2] . Der klassische Ansatz zur Antikörpergewinnung geht von der Immunisierung von Versuchstieren aus. Auch hier verfügen Labors mittlerweile über eine Vielzahl von Methoden, um maßgeschneiderte monoklonale Antikörper zu gewinnen. Der große Vorteil des Immunisierungsansatzes liegt darin, dass der natürliche Reifungsapparat zur Generierung von Antikörpern genutzt wird und dadurch aus kleineren Bibliotheken hochaffi ne und hochspezifi sche Antikörper erhalten werden können, die bereits einer natürlichen Funktions-und Stabilitätsselektion durch die B-Zellreifung unterlagen. Wir haben experimentelle Erfahrung mit beiden Strategien gemacht und in den letzten Jahren festgestellt, dass sich insbesondere immunisierte Hühner in hervorragender Weise für die Gewinnung monoklonaler Antikörper eignen. Due to the large evolutionary distance between birds (Aves) und humans, immunization of chickens with human proteins results in a strong response of the bird's adaptive immune system to proteins of mammalian origin. Additionally, chicken-derived antibodies display less undesired cross-reactivity in analytical setups than conventional rodent-derived antibodies. Due to these features as well as the facile amplifi cation of antibody-coding genes, chicken-derived antibodies emerged as promising molecules for the immunotherapy and various biotechnological applications. DOI 

Als sehr hilfreich für die Isolierung von Antikörpergenen hat sich erwiesen, dass die Anfangs-und Endbereiche der Antikörpercodierenden Genregionen der Hühner stark konserviert sind. Dieser Umstand ermöglicht die einfache und schnelle Extraktion und Amplifi zierung der genetischen Informationen der gesamten Antikörperdiversität mittels PCR.

Ein exemplarisches Verfahren zur Generierung von antigenspezifi schen Antikörperfragmenten aus einem immunisierten Huhn durch Hefe-Display und FACS ist in Abbildung 2 dargestellt.

IgYs interagieren nicht mit humanen Serumbestandteilen (Komplementfaktoren) oder Fc-Rezeptoren auf Blutzellen und eigenen sich damit sehr gut für die Analytik von Patientenproben [10] . Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass Antikörperfragmente aus Hühnern in Schnelltests (lateral fl ow tests) die sensitive Detektion des Schwangerschaftshormons hCG ermöglichen [11] . In einer weiteren Studie wurde die Anwendung eines Hühnerantikörpers in einem papierbasierten COVID-19-Antikörperschnelltest demonstriert [12] . Ebenso konnte der Nutzen von Hühnerantikörpern für die Detektion von humanen Autoantigenen [13] und Parasitenantigenen gezeigt werden [14] . Ein weiteres Anwendungsbeispiel ist die chromatographische Reinigung von humanen Antikörpern. Mithilfe der Hefe-Display-Technologie konnten pH-und Kation-responsive Huhnantikörper identifiziert werden, welche, immobilisiert als Affi nitätsliganden, für die schonende und kostengünstige chromatographische Proteinaufreinigung eingesetzt werden können [15] .

Um Antikörper aus Säugetieren und auch aus Hühnern in der Biomedizin einsetzen zu können, ist eine Antikörperhumanisierung notwendig. Das menschliche Immunsystem identifi ziert Huhnantikörper als fremd, was eine Immunreaktion gegen das therapeutische Protein induzieren würde. Neben einer verkürzten Halbwertszeit wird dadurch oft auch die Wirksamkeit des therapeutischen mAbs stark eingeschränkt, bis hin zum vollständigen Wirksamkeitsverlust [16] . Durch die strukturelle Ähnlichkeit der variablen Domänen der Huhnantikörper und menschlicher Antikörper lassen sich die CDRs, wel-körper und daraus resultierend eine geringe Epitopabdeckung [4] . Üblicherweise werden monoklonale Antiköper (mAbs) und Antikörperfragmente durch Einsatz verschieder Verfahren aus immunisierten Tieren isoliert. Neben dem klassischen Hybridoma-Ansatz [5] haben sich Immunbibliotheken in Kombination mit verschieden Display-Verfahren bewährt. Neben dem Phagen-Display als Methode der Wahl zur Durchmusterung von Huhn-Immunbibliotheken nach spezifi schen Bindern [6] eignet sich auch Hefe-Display perfekt für die Isolierung von Bindern gegen diverse Antigene durch fl uoreszenzaktivierte Hochdurchsatzzellsortierung (FACS). Dabei können nicht nur lösliche, sondern mittlerweile auch membranständige Targets adressiert werden. Unsere Arbeitsgruppe hatte erst kürzlich in einem neuartigen Verfahren eine Huhn-Immunbibliothek im Hefe-Display im Hochdurchsatz gegen Antigene auf der Oberfläche von Tumorzellen erfolgreich durchmustert [7] . Neben Phagen-und Hefe-Display sind außerdem in der Literatur Verfahren beschrieben, Antikörper aus Hühner-Immunbibliotheken auf der Oberfl äche von Säugerzellen zur Durchmusterung bereitzustellen (Mammalian-Display [8] ) oder direkt bestimmte Immunzellen des Huhns zu isolieren, welche Antikörper gegen das gewünschte Antigen produzieren und danach die codieren de Antikörpersequenzen zu isolieren [9] .

Mengen gewonnen werden können, wurden erstmals 1969 von A. Leslie und L.W. Clem detailliert charakterisiert [3] .

IgYs bestehen wie Säugetierantiköper aus zwei schweren und zwei leichten Ketten (Abb. 1). Wie bei Säugetierantikörpern fi ndet man in den variablen Bindedomänen der IgY je drei Bindeschleifen (complementarity determinding regions), CDR1, CDR2 und CDR3 (Abb. 1). Bei großer struktureller Ähnlichkeit zu humanen IgG-Antikörpern findet sich jedoch eine geringe Übereinstimmung in den Aminosäuresequenzen.

Durch die phylogenetische Distanz zwischen Menschen und Vögeln und der einhergehenden niedrigen proteomischen Homologie identifi ziert das Immunsystem eines Huhns in der Regel den Großteil eines zur Immunisierung applizierten humanen Proteins als körperfremd. Daraufhin wird das adaptive Immunsystem des Huhns stimuliert, in dessen Folge spezifi sche Antikörper generiert werden, welche Regionen (Epitope) des Antigens erkennen und binden. In Säugetieren hingegen ist die Immunantwort bei einer Vakzinierung mit einem humanen Antigen aufgrund seiner Sequenz-und Strukturhomologie zu eigenen Proteinen oft nur gering und man beobachtet nicht selten eine geringe Diversität der erhaltenen monoklonalen Anti- [20] .

che für die Antigenbindung verantwortlich sind, mittels in situ grafting und Teilrandomisierung von einzelnen Proteinbausteinen auf humane Antikörperstrukturen übertragen [17] . Dies resultiert in humanisierten Huhnantikörpern mit potenziell verringerter Immunogenität im Menschen. Der erste humanisierte Huhnantikörper, welcher in klinischen Phasen getestet wurde, war der anti-PD1-Antikörper Sym021 von Symphogen A/S. Dieser blockiert die Interaktion von PD-1 auf T-Zellen mit PD-L1 auf Tumorzellen und fungiert so als Checkpointinhibitor [18] . Derzeit laufen mehrere klinische Phase-I-Studien mit Sym021 als Mono-oder Kombinationstherapie in Pa tienten mit vorangeschrittenen Krebserkrankungen (NCT03311412, NCT04641871, NCT04672434). Der Übergang von Sym021 von der Präklinik in frühe klinische Phasen unterstreicht das Potenzial von Huhnantikörpern für therapeutische Anwendungen am Menschen.

In den letzten Jahren gelangten insbesondere auch bispezifi sche Antikörper in den Fokus der biopharmazeutischen Forschung.

Animalfree alternatives and the antibody iceberg

Discussions on the quality of antibodies are no reason to ban animal immunization

Phylogen of immunoglobulin structure and function. 3. Immunoglobulins of the chicken

Chickens with humanized immunoglobulin genes generate antibodies with high affi nity and broad epitope coverage to conserved targets

Establishment of a chicken X chicken hybridoma secreting specifi c antibody

Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display

Isolation of common light chain antibodies from immunized chickens using yeast biopanning and fl uorescence-activated cell sorting

Whole IgG surface display on mammalian cells: Application to isolation of neutralizing chicken monoclonal anti-IL-12 antibodies

Higheffi ciency antibody discovery achieved with multiplexed microscopy

Chicken antibodies: taking advantage of evolution -a review

Yeast surface display in combination with fl uorescence activated cell sorting enables the rapid isolation of antibody fragments derived from immunized chickens

Carbohydrate binding module-fused antibodies improve the performance of cellulose-based lateral fl ow immunoassays

Multiple-antigen immunization of chickens facilitates the generation of recombinant antibodies to autoantigens

Chicken egg yolk antibody (IgY) as diagnostics and therapeutics in parasitic infections -a review

A generic procedure for the Isolation of pH-and magnesium-responsive chicken scFvs for downstream purifi cation of human antibodies

Engineering therapeutic antibodies for patient safety: tackling the immunogenicity problem

Humanization of chicken-derived scFv using yeast surface display and NGS data mining

Sym021, a promising anti-PD1 clinical candidate antibody derived from a new chicken antibody discovery platform

Expeditious generation of biparatopic common light chain antibodies via chicken immunization and yeast display screening

Design of a trispecifi c checkpoint inhibitor and natural killer cell engager based on a 2+1 common light chain antibody architecture

Rapid generation of chicken immune libraries for yeast surface display