key: cord-0708083-z6e26193
authors: Oliver, Antonio; Alarcón, Teresa; Caballero, Estrella; Cantón, Rafael
title: Diagnóstico microbiológico de la colonización-infección broncopulmonar en el paciente con fibrosis quística
date: 2009-02-20
journal: Enferm Infecc Microbiol Clin
DOI: 10.1016/j.eimc.2008.05.004
sha: c74a5cadbc629a2d0714f7f69fa4ccfa23a99c64
doc_id: 708083
cord_uid: z6e26193

Cystic fibrosis (CF), a condition produced by mutations in the gene that encodes the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, is the most prevalent autosomal-recessive hereditary disease in caucasian populations. Among other repercussions, this defect leads to an alteration of respiratory secretions and determines a predisposition for chronic bronchopulmonary colonization-infection, which is the main driver of the high morbidity and early mortality of CF patients. Colonization by Staphylococcus aureus and Haemophilus influenzae is frequent in children younger than 10 years, but mucoid Pseudomonas aeruginosa is by far the most relevant pathogen in adults with CF and is responsible for the progressive bronchopulmonary deterioration. As a consequence of repeated, long-lasting antimicrobial treatments and deterioration of lung function, colonization by multidrug-resistant Gram-negative bacilli, such as Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter spp. and Burkholderia cepacia complex, is also frequent in adult CF patients. The special characteristics of the pathologic process and the microorganisms implicated in CF make it advisable to consider microbiological follow-up of chronic bronchopulmonary colonization-infection in these patients a specific diagnostic entity.

La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad hereditaria autosó mica recesiva má s frecuente en la població n de origen caucá sico. Está producida por mutaciones en el gen que codifica el regulador de la conductancia transmembrana de FQ. Este defecto conduce, entre otras, a la alteració n de las secreciones respiratorias, lo que determina una predisposició n para la colonizació n-infecció n broncopulmonar cró nica, causa principal de la elevada morbilidad y temprana mortalidad de estos pacientes. La colonizació n por Staphylococcus aureus y Haemophilus influenzae es frecuente en niñ os menores de 10 añ os, aunque Pseudomonas aeruginosa con morfotipo mucoide es, con diferencia, el microorganismo má s relevante en el adulto y causa principal del deterioro broncopulmonar progresivo. Como consecuencia del tratamiento antimicrobiano repetido y la alteració n pulmonar se favorece el desplazamiento de los pató genos habituales y se aíslan con mayor frecuencia bacilos gramnegativos no fermentadores, entre los que destacan Stenothrophomonas maltophilia, Achromobacter spp. y Burkholderia cepacia complex. Las connotaciones particulares del propio proceso patoló gico y de los microorganismos implicados hacen recomendable reconocer el seguimiento microbioló gico de la colonizació n-infecció n broncopulmonar en el paciente con FQ como una entidad diagnó stica propia.

& 2008 Elsevier Españ a, S.L. Todos los derechos reservados.

Keywords: Cystic fibrosis Chronic respiratory infection Diagnostic microbiology Pseudomonas aeruginosa Burkholderia cepacia Staphylococcus aureus

Cystic fibrosis (CF), a condition produced by mutations in the gene that encodes the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, is the most prevalent autosomal-recessive hereditary disease in caucasian populations. Among other repercussions, this defect leads to an alteration of respiratory secretions and determines a predisposition for chronic bronchopulmonary colonization-infection, which is the main driver of the high morbidity and early mortality of CF patients. Colonization by Staphylococcus aureus and Haemophilus influenzae is frequent in children younger than 10 years, but mucoid Pseudomonas aeruginosa is by far the most relevant pathogen in adults with CF and is responsible for the progressive bronchopulmonary deterioration. As a consequence of repeated, long-lasting antimicrobial treatments and deterioration of lung function, colonization by multidrug-resistant Gram-negative bacilli, such as Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter spp. and Burkholderia cepacia complex, is also frequent in adult CF patients. The special characteristics of the pathologic process and the microorganisms implicated in CF make it advisable to consider microbiological follow-up of chronic bronchopulmonary colonizationinfection in these patients a specific diagnostic entity. & 2008 Elsevier Españ a, S.L. All rights reserved.

La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad hereditaria autosó mica recesiva má s frecuente en la població n de origen caucá sico y la primera causa de afecció n pulmonar cró nica en la infancia. Su frecuencia estimada oscila entre 1/2.500 y 1/5.000 recié n nacidos vivos, lo que establece una frecuencia de 1 portador por cada 25-50 individuos en la població n general, aunque se observan importantes diferencias dependientes de los grupos é tnicos y regiones geográ ficas.

La FQ se produce como consecuencia de mutaciones en el gen que codifica el regulador de la conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR), situado en el brazo largo del cromosoma 7. El CFTR actú a como canal de cloro y se encuentra en todos los tejidos exocrinos. La mutació n má s comú n es la deleció n de la fenilalanina 508 (DF508), que se encuentra hasta en el 70% de los individuos con FQ. El defecto en el transporte del ió n cloro causa que estos pacientes tengan un sudor característicamente salado y conduce a una deshidratació n de las secreciones del tracto respiratorio, pancreá ticas, hepá ticas, intestinales y genitourinarias aumentando su viscosidad. Como consecuencia, las principales manifestaciones clínicas son respiratorias, gastrointestinales y genitourinarias 1 .

Las alteraciones digestivas fueron la causa de la temprana mortalidad de estos pacientes hasta mediados del siglo pasado, lo que determinó que hasta el 70% de los niñ os con FQ falleciera antes de cumplir el primer añ o de vida. Los tratamientos específicos para corregir las deficiencias digestivas en primera instancia, seguidos posteriormente de otros para combatir las infecciones respiratorias por Staphylococcus aureus, el primer pató geno relacionado con la FQ, determinaron un aumento notable de la esperanza de vida de los pacientes con FQ, situada ya en los 36,5 añ os segú n el ú ltimo informe de la Fundació n Americana para la Fibrosis Quistica 2 . A partir de la segunda mitad del siglo XX, en parte consecuencia de estos avances, empieza a cobrar relevancia la infecció n broncopulmonar cró nica por Pseudomonas aeruginosa, que ya desde hace dé cadas se sitú a como la principal causa de las todavía elevadas morbilidad y mortalidad relacionadas con la FQ 3 .

Consideraciones clínicas y microbioló gicas de la colonizació ninfecció n broncopulmonar cró nica en la fibrosis quística Patogénesis de la colonización/infección broncopulmonar La actividad mucociliar es una de las principales barreras del tracto respiratorio frente a los microorganismos y otros agentes extrañ os. El epitelio ciliado transporta la secreció n mucosa por el á rbol traqueobronquial arrastrando a su paso cualquier partícula o microorganismo que encuentre en su camino. Para que este mecanismo sea efectivo, el moco, que ocupa la parte central de la vía, debe deslizarse sobre la superficie serosa que envuelve los cilios de las cé lulas del epitelio bronquial. La alteració n del CFTR da lugar a un aumento de la reabsorció n de cloro y sodio que se acompañ a de una reabsorció n pasiva de agua y produce deshidratació n de la superficie del epitelio ciliado respiratorio, que impide el correcto deslizamiento del moco a travé s del á rbol traqueobronquial 1, 3 . Esto conlleva un estancamiento del moco, el cual servirá de caldo de cultivo idó neo para diversos microorganismos. Otro factor patogé nico añ adido es la respuesta inflamatoria exagerada, causada por la propia infecció n y por la alteració n presente en el epitelio bronquial, y que se manifiesta principalmente por un intenso infiltrado de neutró filos, los cuales, mediante la secreció n de proteasas, dañ arían aú n má s el tejido bronquial. Ademá s, el acú mulo de ADN, liberado principalmente por la lisis de los neutró filos, incrementa la densidad y la viscosidad de las secreciones. Ademá s de la propia alteració n cualitativa y cuantitativa de las secreciones mucosas y el deficiente aclaramiento mucociliar, hay varias hipó tesis, no sin cierta controversia, que tratan de justificar la enorme predisposició n de los pacientes con FQ para la infecció n broncopulmonar cró nica por pató genos bacterianos determinados, particularmente por P. aeruginosa 3, 4 . Entre ellas, cabría destacar especialmente tres: a) la alteració n del CFTR conduce a la deshidratació n de las secreciones respiratorias, con importante aumento de su osmolaridad, lo cual determina la inactivació n de las betadefensinas, pé ptidos antibacterianos naturales que forman parte del sistema inmunitario innato; b) las cé lulas epiteliales de los pacientes con FQ son deficientes en la sializació n de ganglió sidos. Los asialoganglió sidos actuarían como receptores para P. aeruginosa aumentando su adhesió n al epitelio y, por lo tanto, su persistencia en las vías respiratorias, y c) el CFTR actú a como receptor para el LPS, de tal forma que su alteració n determina una aclaramiento de P. aeruginosa por las cé lulas epiteliales entre 10 y 50 veces menor en los pacientes con FQ, lo que favorece su persistencia en las vías respiratorias.

Finalmente, varios estudios han demostrado que la concentració n de hierro está aumentada en las secreciones respiratorias de los pacientes con FQ, lo cual parece favorecer la persistencia de la colonizació n por P. aeruginosa, segú n muestra un trabajo reciente. Asimismo, estudios recientes indican que la alteració n del CFTR en los macró fagos alveolares reduce la acidificació n de los fagolisosomas, lo cual, limita su capacidad bactericida y, por lo tanto, promueve la persistencia de la infecció n. De igual forma, las cé lulas del epitelio respiratorio de los pacientes con FQ son incapaces de secretar tiocianato, por lo que disminuye drá sticamente su capacidad bactericida a travé s de la formació n de molé culas de oxígeno reactivo.

Por lo tanto, debido a todos estos condicionantes, el paciente con FQ padecerá un cuadro de infecció n broncopulmonar cró nica que se irá exacerbando a lo largo de su vida y que, a pesar de los avances en la antibioterapia y en el tratamiento con agentes mucolíticos y enzimas que rompen el ADN acumulado, sigue siendo, con diferencia, la causa principal de su peor calidad de vida y menor expectativa de supervivencia.

El aná lisis del patró n y la evolució n temporal de la colonizació n en los pacientes con FQ ha permitido definir el concepto de cronoinfecció n por el que los pacientes sufrirían infecciones o colonizaciones siguiendo una secuencia má s o menos establecida dependiente de la edad 3,5,6 . En los de menor edad, las infecciones por virus respiratorios y micoplasmas no son infrecuentes. Con posterioridad y aun en la primera dé cada de la vida, es frecuente el aislamiento de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae que serían rá pidamente relegados a un segundo plano y sustituidos por S. aureus y posteriormente por P. aeruginosa. En la edad adulta, má s del 80% de los pacientes está n cró nicamente colonizados por este microorganismo y en la mayoría de los casos se aísla en su morfotipo mucoso.

Como consecuencia del tratamiento antimicrobiano repetido en los pacientes adultos y del deterioro de la funció n pulmonar, se favorece el desplazamiento de los pató genos bacterianos habituales y se aíslan con mayor frecuencia bacilos gramnegativos no fermentadores entre los que destacan Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter spp. y Burkholderia cepacia. En el Hospital Ramó n y Cajal, en el seguimiento de 81 pacientes con FQ durante 5 añ os, se observó una mayor incidencia de S. aureus en los primeros añ os de vida y un ulterior aumento de los pacientes colonizados con P. aeruginosa ( fig. 1 ). Estos datos son muy similares a los del registro estadounidense de pacientes con FQ 2 . El aislamiento de las micobacterias atípicas en las secreciones respiratorias en pacientes adultos no es infrecuente. El tratamiento prolongado con antimicrobianos en la edad adulta tambié n facilita el asentamiento de levaduras y hongos filamentosos, que complican aú n má s el patró n de colonizació n bronquial. Por ú ltimo, el patró n de colonizació n bronquial no siempre es monomicrobiano y hasta en el 70% de los pacientes pueden coexistir diferentes pató genos. En má s del 50% de ellos aparecen simultá neamente S. aureus y P. aeruginosa, solos o en asociació n con con H. influenzae o S. pneumoniae.

Principales microorganismos implicados en la colonizació ninfecció n broncopulmonar cró nica

Es con diferencia el microorganismo má s frecuente en estos pacientes. Cerca del 60% de ellos está cró nicamente colonizado por este microorganismo, que llegando al 80% en pacientes mayores de 18 añ os. La colonizació n-infecció n por P. aeruginosa se relaciona claramente con mayores morbilidad y mortalidad en el paciente con FQ. Se ha evidenciado un progresivo deterioro de la funció n pulmonar y una disminució n de la supervivencia, y se ha comprobado que su adquisició n en edades tempranas influye negativamente en el pronó stico de la enfermedad 1 . Los pacientes colonizados por P. aeruginosa durante los primeros 5 añ os de vida tienen un riesgo mayor de mortalidad (2,6 veces) que el de los pacientes con FQ no colonizados por este microorganismo. Tambié n se observan unos valores significativamente má s bajos de FEV 1 (volumen espiatorio forzado en el primer segundo), menor percentil de peso y aumento del nú mero de hospitalizaciones. Los factores de riesgo para la colonizació n-infecció n temprana por P. aeruginosa incluyen la infecció n previa por S. aureus, el sexo femenino, la presencia homocigó tica de la mutació n DF508 y el contacto previo con pacientes adultos con FQ.

La adquisició n de este pató geno se produce a partir de microorganismos presentes en el ambiente, aunque la transmisió n cruzada entre pacientes no es del todo infrecuente, particularmente entre miembros de una misma familia. Asimismo, se han descrito brotes epidé micos de colonizació n-infecció n por P. aeruginosa en varias unidades de FQ 7 .

Inicialmente, la colonizació n del tracto respiratorio se produce por morfotipos no mucosos, generalmente sensibles a los antimicrobianos, y se presenta con una baja densidad bacteriana. Con posterioridad, y durante un período de tiempo variable, los cultivos de las muestras respiratorias pueden ser intermitentes. Una vez establecida la colonizació n-infecció n pulmonar cró nica, generalmente por una ú nica línea clonal de P. aeruginosa, resulta prá cticamente imposible conseguir la erradicació n.

El proceso de adaptació n determinante de la persistencia (en la mayoría de los casos de por vida) de P. aeruginosa en las vías respiratorias de los pacientes con FQ incluye cambios tanto fisioló gicos como gené ticos 8 . Entre los primeros destaca la transició n desde el estado de crecimiento planctó nico (cé lulas libres suspendidas en medio acuoso) al de crecimiento en biopelículas o biofilms. Las biopelículas son estructuras supracelulares (comunidades multicelulares) complejas y bien organizadas espacial y funcionalmente que crecen sobre una superficie viva o inerte. La transició n al crecimiento en forma de biopelículas depende de la acció n de los sistemas de comunicació n intercelular lasR-lasI y rhlR-rhlI, que son activados cuando la població n alcanza una suficiente densidad, y por ello se denominan sistemas sensores de quorum (quorum sensing). El crecimiento en forma de biopelículas confiere al microorganismo una notable resistencia tanto a los tratamientos antibió ticos como a la propia respuesta inmunitaria del paciente, que favorece su persistencia.

Ademá s del crecimiento en forma de biopelículas, el desarrollo de la infecció n cró nica por P. aeruginosa se materializa a travé s de un intenso proceso de adaptació n gené tica, que será determinante para su resistencia a las condiciones ambientales (incluidos nuevamente la respuesta inmunitaria y los antibió ticos). Fruto de esta intensa adaptació n emergen gran cantidad de variantes fenotípicas características de la infecció n cró nica, entre las que destacan la hiperproducció n constitutiva de alginato (morfotipo mucoso) o los variantes de lento crecimiento (colonias enanas o small colony variants, SCV). Otras variantes fenotípicas que parecen favorecer la persistencia en las vías respiratorias son los mutantes aflagelados o con modificaciones del LPS. Se ha comprobado que la conversió n al morfotipo mucoide se correlaciona con producció n de anticuerpos y se acompañ a de cambios importantes en los pará metros pulmonares, lo que conlleva una mayor mortalidad 9 . Asimismo, el incremento en el nú mero de variantes morfoló gicas se ha correlacionado con el progresivo deterioro de la funció n pulmonar. Recientemente se ha comprobado que el intenso proceso de adaptació n gené tica durante la colonizació n cró nica favorece la persistencia del microorganismo en las vías respiratorias 10 .

Estas características, a pesar de no formar parte de los mecanismos específicos de resistencia a antibió ticos, establecen una línea base de resistencia in vivo propicia para el desarrollo y la selecció n de variantes con resistencia a mú ltiples antibió ticos (cepas multirresistentes), como consecuencia del uso prolongado de antibió ticos. Este hecho se ve facilitado debido a que P. aeruginosa tiene una extraordinaria capacidad de desarrollar resistencia mediante mutaciones cromosó micas a prá cticamente todos los antibió ticos utilizados, incluidos los betalactá micos, los aminoglucó sidos y las fluoroquinolonas. Finalmente, este desalentador panorama se agrava por la elevada prevalencia en los pacientes con FQ de cepas hipermutadoras, que presentan una frecuencia de mutació n espontá nea (para cualquier gen, incluyendo los implicados en la resistencia a antibió ticos u otras mutaciones adaptativas, como las anteriormente mencionadas) hasta 1.000 veces mayor de lo normal. Entre el 30 y el 60% de los pacientes con FQ está n colonizados por cepas hipermutadoras, segú n varios estudios, hecho extremadamente infrecuente (o1%) en pacientes con infecciones agudas 11 . La base molecular del fenotipo hipermutador es, en la mayoría de los casos, la deficiencia de alguno de los genes que forman parte del sistema de reparació n de emparejamientos erró neos de ADN. Las cepas hipermutadoras aisladas de los pacientes con FQ son mucho má s resistentes a los antibió ticos que las no hipermutadoras; de hecho, la mayor prevalencia de cepas resistentes en los pacientes con FQ que en otros procesos se debe, en gran parte, a la contribució n de las cepas hipermutadoras a las cifras de resistencia. Asimismo, mediante estudios in vitro e in vivo se ha demostrado que las cepas hipermutadoras desarrollan resistencia en pocas horas a prá cticamente todos los antibió ticos antipseudomó nicos cuando se utilizan en monoterapia 12 . Recientemente se ha documentado que la hipermutació n y su relació n con la resistencia a los antibió ticos no son exclusivas de la FQ, sino que tambié n son muy frecuentes en el contexto de otras enfermedades respiratorias cró nicas como bronquiectasias o en la enfermedad pulmonar obstructiva cró nica (EPOC) 13 .

Fue el primer microorganismo reconocido como causante de infecció n pulmonar cró nica en pacientes con FQ. En la era preantibió tica fue uno de los principales implicados en la elevada y temprana mortalidad de estos pacientes. La terapia antiestafilocó cica ha conseguido en las ú ltimas dé cadas una notable reducció n de la morbilidad y la mortalidad por este microorganismo, pero aú n sigue siendo, despué s de P. aeruginosa, uno de los principales pató genos implicados en la infecció n broncopulmonar, especialmente en niñ os menores de 10 añ os. Los datos de 2005 del registro de pacientes de la Fundació n Americana de FQ muestran que, de forma general, el 52% de los pacientes está n colonizados por S. aureus 2 . Ademá s, es el principal pató geno aislado durante los primeros 10 añ os de vida y alcanza su mayor prevalencia (460%) en el grupo de 6-10 añ os de edad.

La persistencia de S. aureus depende fundamentalmente de su capacidad de adhesió n al epitelio respiratorio y para evadir la respuesta inmunitaria una vez producida la colonizació n. Investigaciones recientes indican que S. aureus escapa má s eficientemente de los fagosomas de las cé lulas del epitelio bronquial deficientes en el CFTR 14 . Ademá s, se desarrolla adecuadamente en medios con alta osmolaridad, situació n que se produce en las vías respiratorias del paciente con FQ. S. aureus puede persistir en las vías respiratorias de los pacientes con FQ sin producir alteraciones aparentes. No obstante, se ha apuntado que causa una lesió n inicial con escasa repercusió n funcional que predispondría a la colonizació n posterior por P. aeruginosa. Si bien el tratamiento profilá ctico con betalactá micos ha mejorado notablemente el pronó stico de los niñ os con FQ, hay cierta controversia en torno al tratamiento indiscriminado, ya que un tratamiento prolongado podría llevar a la sustitució n de S. aureus por P. aeruginosa y, por lo tanto, a adelantar el proceso evolutivo de la infecció n cró nica y el deterioro pulmonar. Por otro lado, si bien la resistencia a meticilina no ha sido tradicionalmente un problema importante en los pacientes con FQ, la situació n parece estar cambiando. Los datos de 2005 de la Fundació n Americana muestran que actualmente hasta el 17,2% de los pacientes con FQ está n colonizados por S. aureus resistente a meticilina (SARM). Recientemente se ha documentado la infecció n respiratoria por clones de SARM de origen extrahospitalario productores de la leucocidina de Panton-Valentine (LPV) en pacientes con FQ de Estados Unidos, situació n que podría modificar la patogenia de la infecció ncolonizació n por este microorganismo. La situació n actual en Españ a de la resistencia a la meticilina en el contexto de FQ ha sido poco estudiada, pero puesto que se han detectado recientemente los primeros casos de SARM de origen extrahospitalario, podría seguir el mismo camino descrito en Amé rica y, por lo tanto, será necesario mantener una vigilancia activa de este fenó meno en los pró ximos añ os.

Otro fenó meno preocupante desde el punto de vista de la resistencia a antibió ticos es la alta prevalencia (el 14% segú n un estudio publicado) de cepas hipermutadoras de S. aureus en los pacientes con FQ, al igual que ocurre para P. aeruginosa 15 . Si bien la hipermutació n aparentemente no contribuye al desarrollo de resistencia a la meticilina, puesto que é sta se produce por la adquisició n de determinantes exó genos de resistencia y no por mutació n, sí contribuye notablemente al desarrollo de resistencia a antibió ticos como los macró lidos; facilitando la selecció n de mutaciones en genes ribosó micos. En cualquier caso, la resistencia a macró lidos es cada vez má s frecuente en las cepas de S. aureus de pacientes con FQ, al menos en parte debido al uso extendido de la terapia de mantenimiento con azitromicina. Asimismo, el tratamiento profilá ctico prolongado con cotrimoxazol se ha relacionado con la selecció n de cepas dependientes de timidina por inactivació n del gen thyA que codifica para la timidilato sintetasa. Estas cepas, ademá s de ser resistentes al cotrimoxazol, se caracterizan por producir colonias con morfologías anó malas (SCV) que incluso muchas veces no crecen en medios convencionales y pueden pasar inadvertidas 16 . Estudios recientes demuestran que la coinfecció n con P. aeruginosa (situació n que ocurre de forma frecuente) tambié n determina la selecció n de variantes SCV de S. aureus. Este hecho, ademá s de plantear dificultades diagnó sticas, conlleva una mayor resistencia a los antibió ticos y una mayor capacidad de persistencia en las vías respiratorias de estos pacientes.

Aunque su frecuencia de aislamiento varía segú n el protocolo microbioló gico aplicado, en la mayoría de los trabajos es el tercer microorganismo má s frecuentemente aislado en los pacientes con FQ despué s de P. aeruginosa y S. aureus. Su frecuencia aumenta si se emplean medios selectivos o incubació n en atmó sfera con anaerobiosis 5, 17 .

H. influenzae puede colonizar hasta al 30% de los pacientes con FQ. Su incidencia es mayor en los niñ os de menor edad, si bien tambié n puede aislarse en los pacientes adultos. No hay evidencias claras sobre su papel como factor primario en el deterioro de la funció n pulmonar y su efecto patogé nico estaría en relació n con la carga bacteriana elevada y la respuesta inflamatoria generada. Aunque no es habitual, hay pacientes con colonizació n cró nica, por nuevas cepas o por cepas persistentes, que siguen un patró n similar al que presentan los bronquíticos cró nicos. En los pacientes con FQ se ha encontrado relació n con las exacerbaciones durante el periodo de colonizació n cró nica que suelen ser generalmente breves, remiten con el tratamiento antimicrobiano adecuado e incluso puede erradicarse hasta en el 70% de los casos de las secreciones respiratorias. Cuando esto ocurre, se reducen los anticuerpos contra este microorganismo y se evidencia una mejoría clínica con desaparició n o reducció n de los síntomas.

Las cepas de H. influenzae que se aíslan en el paciente con FQ son típicamente no capsuladas, característica comú n con los encontrados en otras enfermedades respiratorias que cursan con cronicidad 18, 19 . Por ello la vacuna conjugada contra H. influenzae tipo b no tendría utilidad en la prevenció n de la colonizació n en el paciente con FQ. El biotipo má s frecuentemente aislado en estos pacientes es el I, que es uno de los que conllevan una mayor virulencia.

Aunque no hay evidencia clínica, hay acuerdo generalizado del beneficio del tratamiento antimicrobiano en los pacientes con FQ colonizados por este pató geno. Las pautas aplicadas no difieren de las utilizadas en las infecciones respiratorias por este agente en otro tipo de pacientes. Entre el 20 y el 40% de los aislados de H. influenzae son resistentes a la amoxicilina debido a la producció n de betalactamasas. Un nú mero relativamente importante de las cepas de H. influenzae en los pacientes con FQ es resistente a amoxicilina sin producir betalactamasa. Este fenotipo, denominado BLNAR (beta-lactamase-negative ampicillin-resistant), es debido a alteraciones en las PBP que confieren tambié n pé rdida de sensibilidad a la asociació n de amoxicilinaclavulá nico y cefalosporias orales. Su incidencia en un amplio estudio realizado con pacientes seguidos en la Unidad de FQ del Hospital Universitario Ramó n y Cajal fue algo mayor del 5%, pero podrían estar aumentando en los ú ltimos añ os 19 .

Se ha descrito la persistencia prolongada en los pacientes con FQ, incluso de añ os, de cepas de H. influenzae multirresistentes a pesar del tratamiento adecuado con antimicrobianos. Este perfil de multirresistencia parece estar relacionado, al igual que en P. aeruginosa, con cepas hipermutadoras. En Españ a, se han descrito casos de pacientes persistentemente colonizados por H. influenzae resistentes a las fluoroquinolonas. Este hallazgo es excepcional y la selecció n del mecanismo de resistencia implicado en ello, alteraciones en gyrA y parC, se relaciona con la administració n previa de fluoroquinolonas y el fenotipo hipermutador 19, 20 .

En la mayoría de las series, su incidencia no supera el 20%, y es mayor en las etapas iniciales de la enfermedad, en que puede llegar hasta el 50%. En el Hospital Universitario Ramó n y Cajal durante el seguimiento de los pacientes atendidos en su Unidad de FQ entre 1995 y 2003, se encontró una incidencia general anual media del 5,5%; todos los pacientes en los que se aisló tenían menos de 12 añ os edad 21 . En el 35% de los casos, su aislamiento tenía relació n con un episodio de exacerbació n, aunque só lo en el 27% de é stos se identificó como ú nico pató geno durante estos episodios. La utilizació n de medios selectivos, por ejemplo agar sangre suplementado con á cido nalidíxico y colistina, no parece incrementar el porcentaje de aislamientos de S. pneumoniae en los pacientes con FQ.

En cuanto al aspecto de la patogenia, S. pneumoniae se comportaría como S. aureus, que es capaz de adherirse a la superficie mucosa, lo que favorece las infecciones broncopulmonares cró nicas. Otro posible factor de virulencia, comú n con P. aeruginosa y S. aureus, es su capacidad para elaborar productos extracelulares que estimulan la secreció n mucosa y contribuyen a una peor evolució n de las exacerbaciones. Recientemente se ha demostrado una mayor facilidad de los aislados de S. pneumoniae obtenidos de los pacientes con FQ para formar biopelículas en comparació n con los obtenidos de enfermedades invasivas y que tambié n explicaría su posible facilidad para permanecer en el á rbol bronquial 22 . Al igual que H. influenzae, puede producirse una persistencia de clones específicos en muchos casos multirresistentes, que presentan tasas de mutació n mayores que la de los aislados que no proceden de estos pacientes. La detecció n, en estos pacientes, de serotipos similares a los que cubre la vacuna heptavalente contra S. pneumoniae justificaría su utilizació n y podría reducir el estado de portador por serotipos multirresistentes.

Se ha comprobado que los organismos identificados como B. cepacia forman un grupo muy heterogé neo y constituyen un complejo de especies fenotípicamente similares 23 . Hay al menos 9 variedades genó micas dentro del complejo: B. cepacia (variedad genó mica I), B. multivorans (variedad genó mica II), B. cenocepacia (variedad genó mica III), B. stabilis (variedad genó mica IV), B. vietnamiensis (variedad genó mica V), B. dolosa (variedad genó mica VI), B. ambifaria (variedad genó mica VII), B. anthina (variedad genó mica VIII) y B. pyrrocina (variedad genó mica IX) y otras 15 especies dentro del gé nero Burkholderia 24 . La variedad genó mica I es un pató geno de plantas y contiene la especie tipo. La mayoría de los aislamientos de pacientes con FQ se incluyen dentro de B. cenocepacia y B. multivorans.

B. cepacia apareció hace má s de 25 añ os como un importante pató geno oportunista en estos pacientes. Con frecuencia, la infecció n pulmonar producida por esta bacteria es cró nica, difícil de tratar con antimicrobianos por su multirresistencia y conlleva importantes morbilidad y mortalidad. En estos pacientes, se ha asociado con lo que se ha denominado síndrome cepacia, que se caracteriza por fiebre alta, bacteriemia, bronconeumonía, deterioro pulmonar rá pido y muerte en má s del 60% de los casos. La transmisió n entre pacientes se puede producir por contacto directo o indirecto con secreciones de pacientes infectados y se facilita por contacto prolongado entre pacientes con FQ, por compartir equipos, por contacto social, tanto en el medio hospitalario como en reuniones, campamentos, etc. 24 . En algunos centros se excluye a los pacientes colonizados con B. cepacia de los programas de trasplante pulmonar, debido al mal pronó stico 23, 24 . Sin embargo, para otros autores sería necesario valorar la infecció n con diferentes especies dentro del complejo de forma individualizada.

Los estudios epidemioló gicos indican que las diferentes variedades genó micas son diversas en cuanto a su frecuencia de transmisió n y patogenia 24 . B. cenocepacia es frecuente en suelo agrícola, pero no en sitios urbanos, y hasta ahora no está claramente demostrado que los pacientes se contagien de fuentes ambientales. Conlleva una elevada transmisió n y mal pronó stico y la transmisió n entre pacientes se relaciona con uno o dos marcadores gené ticos: gen cblA ()cable Pili*) y BCESM (B. cepacia epidemic strain marker), aunque no se ha encontrado en las cepas de todos los brotes. B. gladioli es un pató geno de plantas aislado tradicionalmente del gladiolo y el arroz. Se ha aislado de muestras de pacientes con FQ, y se ha identificado por su capacidad para crecer en medios selectivos para el aislamiento de B. cepacia. B. gladioli y B. cepacia complex son genotípicamente diferentes pero fenotípicamente muy similares y es difícil diferenciarlas mediante té cnicas convencionales 25 .

Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter spp. y otros bacilos gramnegativos no fermentadores S. maltophilia y Achromobacter xylosoxidans se encuentran má s frecuentemente que B. cepacia complex en pacientes con FQ y enfermedad pulmonar avanzada, pero generalmente son menos virulentos.

S. maltophilia es un bacilo gramnegativo no fermentador, oxidasa negativo y resistente a la mayoría de los antimicrobianos. Hay factores que predisponen a la colonizació n por este microorganismo, como el uso prolongado de antimicrobianos. Sin embargo, parece que no predispone la hospitalizació n previa o el contacto con personas colonizadas, aunque sí se ha descrito colonizació n con la misma cepa en diferentes pacientes 24 . S. maltophilia suele producir una colonizació n transitoria, aunque en alrededor del 10% de los casos se ha documentado colonizació n cró nica 26 . En un estudio, se observó una peor supervivencia a los 5 añ os de los pacientes con S. maltophilia; sin embargo, en otros no se evidencia un deterioro clínico relacionado con esta bacteria 25 . La prevalencia de colonizació n en pacientes con FQ ha aumentado en los ú ltimos añ os, aunque varía de unos centros a otros, en parte, por el uso de diferentes medios selectivos o por los mé todos de identificació n que pueden dar lugar a identificaciones erró neas 24 .

A. xylosoxidans es tambié n un bacilo gramnegativo que puede confundirse con P. aeruginosa no pigmentada o con B. cepacia 25 . No hay estudios que examinen el efecto de esta bacteria en la funció n pulmonar y en la mortalidad. En un estudio, se ha relacionado con exacerbaciones pulmonares en FQ, pero los pacientes estaban colonizados tambié n por P. aeruginosa. No parece que la colonizació n a largo plazo produzca un deterioro claro del estado clínico. Se han descrito casos de pacientes colonizados con la misma cepa en el mismo centro, y aunque no se encontró la fuente, estuvieron hospitalizados al mismo tiempo 24 .

Ralstonia, gé nero establecido en 1995, agrupa diferentes especies pató genas en humanos: R. pickettii, R. paucula, R. gilardii y R. mannitolilytica 25 . Son bacilos gramnegativos no fermentadores, oxidasa positivos, y se consideran pató genos oportunistas que pueden producir infecciones graves en pacientes inmunodeficientes. Estos organismos pueden crecer en los medios selectivos para B. cepacia, y con los mé todos fenotípicos convencionales se pueden identificar de forma erró nea 17 .

Pandoraea es un bacilo gramnegativo no fermentador que se ha aislado de muestras ambientales, muestras clínicas y recientemente en muestras de pacientes con FQ, que es capaz de crecer en medios selectivos para B. cepacia. Este gé nero, descrito en 2000, contiene 5 especies: P. apista, P. sputorum, P. norimbergensis, P. pnomenusa y P. pulmonicola y otras 4 genoespecies todavía sin nombre (variedad genó mica 1 a 4). El gé nero má s cercano filogené ticamente es Burkholderia y comparte características fenotípicas con Ralstonia. Parece que son potencialmente patógenos en pacientes con FQ y se ha descrito transmisió n entre pacientes. Clínicamente es má s virulenta que Ralstonia spp. o B. gladioli. La identificació n fenotípica no es fiable y requiere té cnicas moleculares 17 . Es resistente a muchos antimicrobianos, lo que limita las opciones terapé uticas.

Inquilinus sp. es un nuevo gé nero descrito en 2002, al realizar estudios taxonó micos de las bacterias gramnegativas no habituales obtenidas de secreciones respiratorias de pacientes con FQ. Es un bacilo gramnegativo no fermentador que pueden crecer en medios selectivos para B. cepacia, pero puede no crecer en MacConkey 17 . En este gé nero se incluye la especie I. limosus má s otra aú n sin nombre. Puede tener aspecto mucoide y es resistente a colistina y a todos los betalactá micos, excepto imipenem. No hay datos suficientes para conocer el significado clínico de estas bacterias en estos pacientes.

En pacientes con FQ se han aislado, ademá s, otras bacterias gramnegativas, como Comamonas acidovorans, Comamonas testosteroni, Acinetobacter calcoaceticus o Chryseobacterium indologenes.

Las enterobacterias se pueden aislar del tracto respiratorio de pacientes con FQ, aunque generalmente son colonizaciones transitorias y no está n relacionadas con enfermedad grave 17 . Se pueden encontrar en el 1-4% de los pacientes, y en el 10% de los casos de exacerbaciones agudas. Se aíslan con mayor frecuencia en niñ os de 0 a 5 añ os, generalmente antes de que se produzca una colonizació n cró nica por P. aeruginosa. Entre las enterobacterias, Escherichia coli es la que se aísla con mayor frecuencia, seguido de Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp. y Proteus spp. Su detecció n puede ser compleja cuando está presente P. aeruginosa por competencia durante el crecimiento. Aunque no es muy frecuente, las enterobacterias pueden producir infecciones cró nicas, desarrollando fenotipos altamente mucoides, similares a los de P. aeruginosa, con la que pueden llegar a confundirse a simple vista si no se realiza la prueba de la oxidasa. Al igual que con P. aeruginosa, la infecció n cró nica conlleva el desarrollo de multirresistencia. Ocasionalmente, se ha descrito tambié n la presencia de cepas productoras de betalactamasas de espectro extendido, lo cual dificulta el control de la colonizació n por estos microorganismos.

Los pacientes con FQ tienen un riesgo mayor de sufrir colonizació n-infecció n respiratoria por micobacterias no tuberculosas (MNT), probablemente debido a bronquiectasias e infecciones cró nicas y recurrentes del pulmó n 3 . A diferencia de lo que ocurre en el caso de la tuberculosis, el contagio se produce muy raramente por contacto persona a persona y el tipificado de las cepas aisladas en los pacientes ha demostrado la ausencia de transmisió n cruzada entre ellos. Las MNT tienen una distribució n amplia en la naturaleza y se encuentran principalmente en el agua, el suelo, las plantas y los animales. El aumento aparente en el aislamiento de MNT en estos pacientes probablemente esté relacionado con su mayor supervivencia y la mejora en los mé todos de detecció n e identificació n de las MNT 27, 28 .

En series publicadas, la prevalencia varía ampliamente, segú n los centros, del 2 al 28%, si bien la media se situaría entre el 5 y el 15% [27] [28] [29] . Las prevalencias má s bajas podrían deberse a series basadas en un solo cultivo, a no utilizar té cnicas de descontaminació n adecuadas para evitar el sobrecrecimiento de otras bacterias o la poca calidad de las muestras, sobre todo en pacientes pediá tricos con dificultades para expectorar.

Las especies que se aíslan má s frecuentemente son M. avium complex (MAC), M. avium con mayor frecuencia que M. intracellulare, seguida de M. abscessus. La edad de los pacientes parece influir en la frecuencia y las especies de MNT aisladas. En menores de 10-12 añ os la prevalencia sería del 4-5% y la má s frecuente, M. abcessus, junto con otras MNT de crecimiento rá pido como M. chelonae y M. fortuitum 28 . La prevalencia va aumentando con la edad, má s del 15% en mayores de 15 añ os, lo que puede ser un reflejo de la cada vez mayor longevidad de los pacientes con FQ. M. abscessus se aísla en un porcentaje similar (5%) a cualquier edad, mientras que MAC se aísla fundamentalmente en mayores de 10-15 añ os. Otras MNT de crecimiento lento aisladas son M. gordonae y má s raramente M. kansasii. En nuestro país no se ha publicado ningú n estudio multicé ntrico, pero sí se han notificado algunas series con frecuencia de aislamiento variable, del 4 al 25% 29 .

Las bacterias de crecimiento rá pido en el esputo de los pacientes con FQ pueden ser una causa de que la prevalencia real de MNT esté subestimada. La tasa de cultivos contaminados, en el caso de pacientes con FQ (24-45%), contrasta claramente con la general (2,5-3%) del Laboratorio de Micobacterias. Principalmente P. aeruginosa, que se encuentra en el tracto respiratorio de má s del 80% de estos pacientes y alrededor de un tercio de los aislados presentan fenotipo mucoso y sobreviven al tratamiento de descontaminació n sistemá tico con N-acetil-L-cisteína+2% NaOH. La inoculació n simultá nea en medios só lidos, preferentemente Lowestein-Jensen, y medios líquidos mejora el nú mero de micobacterias recuperadas y disminuye el de muestras finalmente informadas como contaminadas hasta cerca del 17%. Para eliminar eficazmente P. aeruginosa, el procesamiento previo de las muestras respiratorias de pacientes con FQ debería incluir tratamiento con á cido oxá lico al 5% en un segundo paso, despué s de la descontaminació n con N-acetil-L-cisteína+2% NaOH. Este tratamiento má s agresivo reduce eficazmente la contaminació n por bacterias de rá pido crecimiento hasta un 6-8%, pero puede inactivar entre un 25 y un 30% de las micobacterias, sobre todo en muestras con una carga bacteriana baja. Para minimizar este efecto, se ha propuesto realizar la descontaminació n en dos etapas con N-acetil-L-cisteína+2% NaOH y el á cido oxá lico al 5% só lo del cultivo en medio líquido cuando resulte contaminado. De esta forma se puede llegar a obtener hasta un 25% de mejora en la sensibilidad.

Recientemente, se ha descrito la utilizació n de un mé todo de descontaminació n con cicloheximida que mejora el aislamiento de MNT, principalmente M. abscessus. Este mé todo es má s sencillo y rá pido pero tiene el inconveniente de que la muestra descontaminada no puede inocularse a los medios líquidos automatizados. Esto se debe a que la adició n de lecitina al medio líquido, necesaria para neutralizar la acció n de la cicloheximida, da lugar a fluorescencia inespecífica que impide la lectura automá tica de los frascos.

La distinció n entre infecció n pulmonar activa y colonizació n no es fá cil en el paciente con FQ. Las recomendaciones publicadas por la American Thoracic Society (ATS) para el diagnó stico de infecció n pulmonar por MNT incluyen criterios bacterioló gicos, clínicos y radioló gicos; los dos ú ltimos son muy difíciles de establecer. La definició n de infecció n requiere un mínimo de tres esputos o lavados bronquiales positivos o 2 cultivos positivos con al menos una tinció n positiva en los 12 meses previos. Si se obtiene un cultivo positivo para MNT, es obligatorio realizar cultivos seriados para comprobar si se aísla la misma especie de MNT y, en el caso de que sean negativos, prolongarlos al menos durante 1 añ o para descartar la infecció n. En bastantes pacientes la colonizació n es ocasional ya que los cultivos repetidos son negativos, sobre todo en el caso de M. avium. La tinció n directa es de gran importancia, ya que los pacientes que presentan tinciones positivas cumplen criterios bacterioló gicos con mayor frecuencia y se ha apuntado que podrían ser indicativas de infecció n activa. Asimismo, el aislamiento repetido de MNT se asocia significativamente con enfermedad pulmonar granulomatosa diagnosticada por necropsia en pacientes con FQ. Los pacientes con aislamiento de M. abscessus cumplen los criterios bacterioló gicos con mayor frecuencia que los pacientes con cultivo positivo del grupo MAC. En aproximadamente dos tercios de los pacientes con M. abscessus se observan alteraciones en la tomografía computarizada y se han descrito con mayor frecuencia casos de enfermedad invasiva mortal. M. abscessus, ademá s, puede ser la causa de infecció n diseminada tras el trasplante pulmonar y la posterior terapia inmunosupresora.

La identificació n de las especies es esencial y puede requerir té cnicas gené ticas. Dentro del grupo MAC se deben utilizar medios de identificació n que diferencien las especies M. avium de M. intracellulare. Las té cnicas utilizadas son la hibridació n con sondas DNA-RNA (AccuProbe), la amplificació n de secuencias gené ticas seguidas de hibridació n (INNO-LIPA), restricció n (PCR-RFLP del gen hsp65) o secuenciació n gené tica (PCR+ secuenciació n de la subunidad 16S del ARNr o del gen hsp65). M. abcessus es la má s pató gena y resistente de las micobacterias de crecimiento rá pido. Es esencial diferenciarla de M. chelonae ya que el tratamiento en las infecciones por M. abcessus es especialmente difícil y puede requerir cirugía en las infecciones localizadas si la funció n pulmonar es adecuada. Pueden diferenciarse fá cilmente por la tolerancia al cloruro só dico o la utilizació n del citrato, pero puede ser necesaria la amplificació n seguida de restricció n del gen hsp65 o secuenciació n gené tica del 16S del ARNr o del gen hsp65.

El estudio de la sensibilidad se recomienda só lo en el caso de aislamientos que se consideren clínicamente significativos. En los aislamientos de MAC el tratamiento antibió tico está protocolizado, pero puede ser recomendable el estudio de la sensibilidad a los macró lidos (claritromicina). En el caso de M. abcessus, no hay un consenso sobre el tratamiento a utilizar, ya que esta micobacteria es especialmente resistente a numerosos antibió ticos y la elecció n del tratamiento se debe guiar por el valor de las CMI en medio líquido o, dada la complejidad de estas té cnicas, por los resultados obtenidos por la té cnica de E-test.

Con respecto a la infecció n por M. tuberculosis, es rara en pacientes con FQ y se encuentran muy pocas referencias en la literatura por lo que es difícil conocer su incidencia. En las series que recogen este dato el porcentaje de M. tuberculosis es mucho menor (0-2%) frente al aislamiento de MNT (4-25%). A diferencia de las MNT que se encuentran en el medio ambiente, M. tuberculosis se transmite persona a persona y es una seria complicació n para el paciente con FQ, sobre todo si se trata de aislados multirresistentes, por lo que es recomendable descartarla rá pidamente mediante té cnicas de detecció n e identificació n gené ticas directas cuando la tinció n de la muestra sea positiva.

La prevalencia de Aspergillus en muestras respiratorias de pacientes con FQ varía desde el 6 al 57% segú n la edad (suele aparecer durante la adolescencia), el lugar de residencia (afecta má s a pacientes del medio rural) o las condiciones climá ticas (mayor incidencia en zonas costeras). En aproximadamente el 75% persiste en cultivos sucesivos y su aislamiento normalmente representa colonizació n pulmonar. En el 2-10% de estos pacientes la principal complicació n es la aspergilosis broncopulmonar alé rgica (ABPA), una hipersensibilizació n a los antígenos de Aspergillus con estimulació n de la respuesta inmunitaria celular y producció n de anticuerpos específicos 30 . La prevalencia es baja en menores de 6 añ os y es má s elevada en los pacientes en peores condiciones clínicas. Las principales manifestaciones de esta enfermedad son respiració n sibilante, aparició n de infiltrados pulmonares, bronquiectasias y fibrosis.

El diagnó stico clínico de ABPA es difícil en estos pacientes ya que las manifestaciones de la enfermedad no son fá ciles de diferenciar de las exacerbaciones agudas que sufren. Tampoco lo es el diagnó stico microbioló gico ya que el aislamiento de Aspergillus en el esputo no es suficiente para el diagnó stico de ABPA, pero sí se ha demostrado una correlació n positiva entre anticuerpos específicos en suero y afectació n de la funció n pulmonar. El tratamiento profilá ctico con antibió ticos predispone a la colonizació n por hongos, aunque raramente se han notificado casos de aspergiloma o aspergilosis invasiva en pacientes con FQ, excepto en trasplantados pulmonares. La presencia en el esputo, sobre todo, de la forma mucoide de P. aeruginosa puede inhibir el crecimiento de hongos, por lo que se recomienda el uso de medios de cultivo para hongos, como el agar Sabouraud glucosa, suplementados con antimicrobianos, como ciprofloxacino o amikacina. La especie mayoritaria es Aspergillus fumigatus, aunque otras especies tambié n se han descrito en una proporció n mucho menor. Scedosporium apiospermum (3-8,6%) sería el segundo en importancia en algunas series. A diferencia de Aspergillus, sus esporas se encuentran raramente en el ambiente y los mecanismos de transmisió n y colonizació n cró nica no está n claros. Podría estar asociado tambié n a episodios de ABPA, pero la presencia de reacció n cruzada con determinados antígenos de A. fumigatus hace difícil demostrarlo en los pacientes que presentan anticuerpos frente a Aspergillus.

Las levaduras se aíslan con mayor frecuencia, el 75-78% de los pacientes con FQ, y Candida albicans es la especie mayoritaria. Se presenta en pacientes que reciben tratamiento prolongado con antibió ticos o glucocorticoides y el origen es principalmente endó geno a partir de la propia flora del paciente. Se han notificado casos de colonizació n por la levadura melaninogé nica Exophiala dermatitis, y su prevalencia es del 2 al 15% cuando se emplea un medio de cultivo específico (agar eritritol cloranfenicol, ECA) y se prolonga la incubació n hasta 4 semanas. El riesgo de infecció n por esta levadura en pacientes con FQ está todavía por establecer.

A pesar del papel central de las infecciones bacterianas, hay otros factores no bacterianos implicados en la progresió n de la enfermedad pulmonar en los pacientes con FQ. Durante la ú ltima dé cada se ha evaluado en estos pacientes el impacto de las infecciones por virus respiratorio sincitial (VRS), virus de la gripe, adenovirus, virus parainfluenza, rinovirus y, má s recientemente, metapneumovirus, pero no por otros virus causales de infecciones respiratorias como coronavirus o bocavirus 31 . Tambié n se ha considerado la implicació n de bacterias atípicas como Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Bordetella pertussis y Legionella pneumophila 31 . En general, en el 5-20% de los pacientes con exacerbaciones agudas se puede demostrar una etiología viral o por las bacterias señ aladas, frente al 0-5% en pacientes en situació n estable. La importancia de estas infecciones en los pacientes con FQ probablemente esté subestimada, ya que en la mayoría de los estudios el diagnó stico fue seroló gico y adolecen de la falta de té cnicas directas y rá pidas. Recientemente tambié n se ha señ alado a Pneumocystic jirovecci como un agente que podría tener un papel relevante en la FQ y cuya importancia estaría infravalorada.

La incidencia de infecciones virales en estos pacientes no es mayor que en la població n general y en niñ os menores de 2 añ os incluso má s baja, debido probablemente a una exposició n menor. Sin embargo, la infecció n respiratoria puede ser mucho má s grave con mayor afectació n de vías bajas, mayor incidencia de exacerbaciones agudas, hospitalizació n y deterioro de la funció n pulmonar. Ademá s, puede predisponer a la infecció n por bacterias al dañ ar el epitelio respiratorio y facilitar la adherencia bacteriana. Algunos autores han encontrado asociació n con un riesgo mayor de infecció n por P. aeruginosa, o con una afectació n mayor, indicada por el aumento en el título de anticuerpos anti-Pseudomonas, en los pacientes con infecció n cró nica por este microorganismo. Un mayor nú mero de infecciones virales al añ o se correlaciona con progresió n de la enfermedad pulmonar con disminució n del índice de Swachman, (FEV 1 ) o la capacidad vital forzada (FVC) y se ha demostrado que un nú mero significativo de episodios de exacerbació n pulmonar son precedidos por infecciones respiratorias virales.

El lavado broncoalveolar es la muestra considerada de referencia en el estudio microbioló gico del paciente con FQ. Sin embargo, el esputo es la má s utilizada, por su facilidad de obtenció n y buena correlació n con el lavado broncoalveolar. En los pacientes en quienes no se puede obtener muestras de esputo o en los niñ os pequeñ os suele recurrirse a los aspirados bronquiales o a tomas retrofaríngeas. Otras muestras utilizadas son los broncoaspirados y cepillados bronquiales. La recogida de las muestras en estos pacientes debe seguir las consideraciones generales 32 .

Esputo. Su toma ha de evitar la contaminació n con microbiota del tracto respiratorio superior, ha de recogerse en envases esté riles y remitirse con la mayor celeridad para su estudio. Si el procesamiento no es inmediato, se recomienda mantener la muestra a 4 1C, ya que aunque a temperatura ambiente la viabilidad de S. aureus y P. aeruginosa no se ve afectada en las primeras 24-48 h, si bien puede afectar a los recuentos bacterianos. En el caso de H. infuenzae y S. pneumoniae los recuentos disminuyen drá sticamente con el tiempo y los cultivos podrían ser falsamente negativos. Para evitarlo, puede congelarse mejor que mantenerse en refrigeració n.

Lavado broncoalveolar. Está recomendado en los pacientes con escasa expectoració n, con antibioterapia previa prolongada, en los casos particulares de sospecha de colonizació n por B. cepacia, cuando se vaya a aplicar té cnicas de biología molecular o en el seguimiento de los pacientes sometidos a trasplante pulmonar.

Muestras retrofaríngeas. Su valor diagnó stico puede variar dependiendo de la edad del paciente y del patró n de colonizació n. En el caso de P. aeruginosa y en pacientes menores de 5 añ os el valor predictivo positivo es cercano al 95% y el valor predictivo negativo, del 40%, y son algo inferiores para S. aureus. Por el contrario, en pacientes jó venes sin expectoració n el valor predictivo positivo para P. aeruginosa es menor (83%) y algo mayor el valor predictivo negativo (70%); los valores correspondientes para S. aureus son del 91 y el 80%, respectivamente. Se ha demostrado que el valor diagnó stico aumenta cuando se incrementa el nú mero de tomas orofaríngeas estudiadas.

En general, se recurre a la tinció n de Gram para valorar la idoneidad del esputo para el cultivo. El cultivo debe realizarse con los esputos que presenten má s de 25 leucocitos y menos de 25 cé lulas epiteliales por campo microscó pico con bajo aumento. En los pacientes con FQ no se considera imprescindible su realizació n puesto que puede no ser suficientemente ilustrativa de los microorganismos presentes, ya que é stos pueden formar acú mulos en las secreciones (biopelículas), o de las cé lulas inflamatorias, que no siempre se distribuyen de forma homogé nea. Se estima que con los criterios habituales de valoració n de la tinció n de Gram, hasta el 40% de las muestras de esputo de los pacientes con FQ serían inadecuadas para el cultivo y, sin embargo, ofrecen resultados valorables.

Las muestras respiratorias de los pacientes con FQ, y en particular los esputos, presentan una elevada consistencia y deben someterse a un proceso de homogeneizació n antes de proceder a su cultivo. Habitualmente se emplean agentes mucolíticos (N-acetilcisteína) o ditiotreitol. Tambié n se ha recomendado emplear una homogeneizació n mecá nica (sonicació n suave) o utilizar simplemente suero salino 17 .

El diagnó stico y el seguimiento microbioló gico cualitativo y cuantitativo de la colonizació n-infecció n de las vías respiratorias son una herramienta clave para el manejo clínico de los pacientes con FQ. Segú n las ú ltimas recomendaciones de la Fundació n Americana de FQ, se deben obtener muestras respiratorias para estudio microbioló gico en las siguientes premisas: a) al menos una cada 3 meses en pacientes clínicamente estables y sin exacerbaciones pulmonares; b) durante los cuadros de exacerbació n pulmonar; c) en caso de cambio del estado clínico; d) en caso de hospitalizació n, y e) cuando esté indicado por motivos epidemioló gicos. Es particularmente importante realizar un seguimiento continuo a los niñ os con diagnó stico temprano de FQ que permita detectar la colonizació n inicial por P. aeruginosa y la instauració n de tratamientos antimicrobianos agresivos para prevenir la persistencia de la colonizació n inicial y retrasar la infecció n cró nica 17 . Ademá s de la necesidad de utilizar medios selectivos específicos, otra recomendació n particular es realizar siembras cuantitativas que permitan conocer la cantidad de los distintos microorganismos presentes en las secreciones respiratorias, un seguimiento má s preciso de la evolució n temporal del proceso de colonizació n cró nica y valorar la eficacia de los distintos tratamientos instaurados 33 . Ademá s, puede facilitar el aislamiento de pató genos que esté n en baja proporció n, así como la detecció n de un mayor nú mero de morfotipos de P. aeruginosa. Desde el punto de vista metodoló gico, la siembra cuantitativa puede realizarse siguiendo los procedimientos convencionales de dilució n logarítmica seriada de la muestra seguida de siembra por extensió n en los medios indicados, aunque esta labor tediosa puede verse facilitada por el uso de sistemas semiautomá ticos de siembra cuantitativa, como los sistemas de siembra en espiral.

El cultivo microbioló gico de las secreciones respiratorias de los pacientes con FQ debe incluir medios generales y selectivosdiferenciales para los pató genos habituales y una incubació n algo má s prolongada que la que se realiza con las muestras de otros pacientes. Con ello se facilita la recuperació n de microorganismos que se encuentren en baja proporció n, sobre todo cuando hay una colonizació n simultá nea con P. aeruginosa. Se recomienda una incubació n de al menos 48 h, las primeras 24 h a 35-37 1C y luego a 30 1C para facilitar el crecimiento de posibles bacilos gramnegativos no fermentadores. En algunos protocolos se recomienda específicamente la incubació n de los medios entre 3 y 5 días. En la tabla 1 se indican los medios de cultivos má s utilizados, las condiciones ó ptimas de incubació n y su objetivo.

El cultivo de micobacterias requiere la utilizació n de protocolos y medios específicos y una comunicació n expresa al laboratorio de microbiología de esta solicitud para establecer los cultivos y condiciones que aseguren su aislamiento. En todos los casos en que se solicite el cultivo para micobacterias es necesario realizar una baciloscopia mediante tinció n de á cido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen) o de fluorescencia adecuada para estos micro-organismos (auramina-rodamina). Una tinció n positiva no indica la presencia de M. tuberculosis ya que, como se indicó con anterioridad, este pató geno es infrecuente en el fibró tico quístico, no así las micobacterias atípicas. La frecuente presencia de P. aeruginosa en los esputos de estos pacientes requiere una descontaminació n eficiente antes de su cultivo.

Los medios de cultivo empleados para los hongos no difieren de los utilizados habitualmente para muestras en las que se sospeche la presencia de estos microorganismos (tabla 1). Se ha recomendado la adició n de gentamicina, amikacina o ciprofloxacino para inhibir la fuerte carga bacteriana que puede dificultar su crecimiento.

Consideraciones generales para la identificación de los agentes etiológicos en el contexto de la fibrosis quística En té rminos generales, para identificar los agentes etioló gicos implicados pueden seguirse los procedimientos empleados habitualmente en cualquier otro proceso infeccioso, aunque es importante tener en cuenta una serie de consideraciones específicas.

La identificació n de S. aureus mediante las pruebas tradicionales de la coagulasa o la DNasa no presenta mayores problemas en el contexto de la FQ, aunque las morfologías coloniales atípicas (pequeñ o tamañ o, no hemolíticas, no pigmentadas) de los mutantes SCV auxotró ficos para timidina, típicos de esta enfermedad, pueden dificultar su reconocimiento en los medios de cultivo.

P. aeruginosa es, en principio, fá cilmente reconocible en el laboratorio. No obstante, en los pacientes con FQ es muy frecuente encontrar mú ltiples morfologías coloniales atípicas entre las que cabe destacar las colonias mucoides o las SCV 33 . Otras morfologías coloniales frecuentes en la FQ son los morfotipos metá lico y el rugoso. Ademá s, es frecuente encontrar cepas no pigmentadas, carentes del pigmento verde característico; en otras ocasiones presentan otros diferentes, como ocurre en las cepas de pigmentació n marró n, hiperproductoras de piomelanina 33 comerciales, como el API 20NE o las incluidas en los sistemas comerciales de microdilució n para la identificació n y el estudio de sensibilidad (MicroScan, Wider, Vitek, etc.), resulta a menudo dificultosa, principalmente debido al frecuentemente lento crecimiento en medio líquido de estas cepas, así como a su muchas veces disminuida capacidad de asimilació n de los sustratos incluidos. Teniendo en cuenta que B. cepacia es altamente transmisible, resistente a muchos antimicrobianos y puede conllevar un mal pronó stico, es importante usar mé todos adecuados para su detecció n e identificació n 32 . B. cepacia, especialmente cuando se obtiene de muestras respiratorias de pacientes con FQ, puede necesitar 3 días de incubació n antes de que se vean las colonias en el medio selectivo. Las colonias en agar sangre o en los medios selectivos son lisas y ligeramente levantadas y, ocasionalmente, mucoides. Las colonias en MacConkey se ponen de rosa oscuro a rojo debido a la oxidació n de lactosa en incubaciones prolongadas (4 a 7 días). La mayoría de los aislamientos son no pigmentados, pero en medios con hierro, como TSI, muchas cepas producen un pigmento amarillo brillante. Ademá s, las colonias de B. cepacia tienen un olor característico. La mayoría de las cepas del complejo B. cepacia oxidan la sacarosa, el adonitol o ambos, mientras que R. pickettii no oxida ninguno de los dos. La mayoría de B. cepacia son lisina descarboxilasa positiva, mientras que no lo son R. pickettii, B. gladioli o Pandoraea spp. B. gladioli no oxida la lactosa, la maltosa y la sacarosa. Sin embargo, algunas B. cepacia de la variedad genó mica III (B. cenocepacia) tampoco acidifican estos azú cares.

Los sistemas de identificació n comerciales no son capaces de diferenciar entre las diferentes especies dentro del complejo y a menudo fallan en separar B. cepacia complex de otras especies o gé neros relacionados como B. gladioli, R. pickettii, R. mannitolilytica y Pandoraea spp. 33 . En los estudios que han comparado diferentes sistemas comerciales, el API 20NE parece ser el mejor sistema comercial para identificar B. cepacia complex. Los sistemas automatizados como Vitek o MicroScan no son seguros para identificar estas bacterias. Se han usado diferentes mé todos para identificar las variedades genó micas dentro del gé nero Burkholderia. Las pruebas fenotípicas pueden ser capaces de diferenciar B. multivorans y B. stabilis. Entre las especies dentro del complejo hay algunas características que pueden ayudar a la identificació n. Por ejemplo, B. multivorans, B. stabilis y B. dolosa no son capaces de oxidar la sacarosa. B. stabilis es ornitina descarboxilasa positiva, mientras que las otras dos son negativas. B. multivorans y B. dolosa se diferencian en la lisina descarboxilasa, pero es positiva en só lo el 53% de B. multivorans.

En cualquier caso, frecuentemente es difícil diferenciar estas especies mediante té cnicas convencionales y se requiere la utilizació n de té cnicas moleculares, descritas en apartados posteriores.

La periodicidad recomendada para la realizació n de estudios de sensibilidad a los antibió ticos de las cepas de P. aeruginosa de pacientes con FQ es esencialmente la misma que la recomendada para la obtenció n de muestras respiratorias. En té rminos generales, la sensibilidad de los aislados procedentes de las exacerbaciones pulmonares suele coincidir con aquella obtenida en los ú ltimos cultivos realizados en situació n basal; por lo tanto, se puede utilizar estos datos para establecer las pautas empíricas iniciales. Debido a que las diferentes variantes fenotípicas de P. aeruginosa frecuentemente presentan distintos patrones de resistencia a los antibió ticos, debe estudiarse la sensibilidad de todos los morfotipos detectados en los cultivos.

Respecto a las té cnicas que se debe emplear, se consideran de referencia la dilució n en agar y la microdilució n, segú n las directrices del CLSI. Los sistemas comerciales de microdilució n han logrado, en general, resultados poco satisfactorios, con altas tasas de errores muy graves (falsa sensibilidad), y por lo tanto no se recomienda utilizarlos 34 . Por el contrario, tanto la difusió n con discos como el Etest (qué ademá s permite determinar el valor preciso de CMI) han obtenido resultados satisfactorios en comparació n con las té cnicas de referencia, por esto la Fundació n Americana de FQ recomienda ené rgicamente su empleo como té cnica sistemá tica en detrimento de los sistemas comerciales de microdilució n. El Etest, ademá s, permite determinar la CMI de tobramicina en un amplio intervalo de concentraciones y, por tanto, aplicar los dos puntos de corte propuestos para este antibió tico: el recomendado por el CLSI para administració n por vía sisté mica (resistente X16 mg/ml) y el recomendado recientemente para administració n por vía inhalatoria (resistente X128 mg/ml) 35 . Independientemente de la té cnica utilizada para el estudio de la sensibilidad, debe prolongarse la incubació n de las placas al menos hasta 24 h completas, y en los casos de variantes de lento crecimiento pueden ser necesarias hasta 48 h de incubació n. Es asimismo recomendable el uso de densidades bacterianas má s elevadas para el estudio de las cepas mucosas (1 McFarland en lugar del 0,5 convencional), ya que el nú mero de cé lulas viables, a igual densidad, es menor en estas cepas por la gran cantidad de alginato producido.

Finalmente, tanto la difusió n con discos como el Etest, al contrario que la microdilució n, permiten la detecció n de cepas hipermutadoras mediante la documentació n de las subpoblaciones de mutantes resistentes (SMR) características de este tipo de cepas 33, 36 . Segú n estudios previos, la presencia de SMR para al menos 3 de los antibió ticos probados (ceftazidima, imipenem, meropenem, ciprofloxacino y tobramicina) puede utilizarse como criterio en la identificació n de este tipo de cepas. La detecció n de cepas hipermutadoras puede ser de utilidad para el manejo clínico de la colonizació n-infecció n cró nica por P. aeruginosa, ya que, como se ha comentado anteriormente, estas cepas son capaces de desarrollar resistencia rá pidamente a la mayoría de los antibióticos y, por lo tanto, siempre se debe utilizar terapia combinada para su tratamiento.

Debido a la frecuente presencia de cepas de P. aeruginosa multirresistentes e incluso panresistentes en el contexto de la FQ, en ocasiones puede ser necesario recurrir al estudio de la actividad de combinaciones de antibió ticos (estudios de sinergia) para la elecció n del tratamiento má s adecuado. La té cnica de referencia, aunque tediosa, es la microdilució n en tablero de ajedrez. Tambié n se han evaluado té cnicas basadas en el Etest, con resultados aceptables y, por lo tanto, aparentemente aplicables en la prá ctica habitual por su relativa sencillez. Otra té cnica, utilizada actualmente en centros de referencia en Estados Unidos, determina la actividad bactericida de combinaciones de dos o má s antibió ticos (té cnica denominada MCBT de las siglas inglesas multiple-combination bactericidal antibiotic testing). No obstante, su uso no mejoró la respuesta clínica en comparació n con la elecció n de antimicrobianos basada en los estudios de sensibilidad convencionales, por lo que no se recomienda su utilizació n de forma sistemá tica, aunque puede resultar ú til para casos particulares de infecció n por cepas multirresistentes o panresistentes 17 .

Sin á nimo de pretender realizar una revisió n exhaustiva de las té cnicas, condiciones y connotaciones, má s adecuadas para el estudio de la sensibilidad a los antibió ticos de todos y cada uno de los pató genos potencialmente causantes de colonizació ninfecció n respiratoria cró nica en los pacientes con FQ, este apartado se limitará a reseñ ar los aspectos diferenciales o de particular relevancia en el contexto de esta enfermedad.

Para el estudio de la sensibilidad a antibió ticos de S. aureus de FQ pueden seguirse los procedimientos convencionales utilizados en otros tipos de infecciones. Cabe destacar, no obstante, la creciente relevancia del SARM en el contexto de FQ y, por lo tanto, la importancia de su correcta detecció n. Tanto el disco de cefoxitina, la siembra en medio de cribado con oxacilina como la aglutinació n en lá tex para la detecció n de la PBP2a o la detecció n por PCR del gen mecA resultan adecuados para este propó sito. La detecció n de la resistencia a meticilina por las té cnicas basadas en el cultivo del microorganismo puede ser má s compleja en los mutantes SCV, por lo tanto, es especialmente recomendable en estos casos la detecció n directa de la PBP2a o del gen mecA.

Respecto al estudio de la sensibilidad a antibió ticos de H. influenzae, cabe destacar dos aspectos diferenciales característicos de las cepas obtenidas de pacientes con FQ. En primer lugar es importante tener en cuenta la relativamente alta prevalencia (45%), al menos en nuestro medio, de cepas BLNAR. Por tanto, la evaluació n de la resistencia a betalactá micos en este microorganismo no debe basarse ú nicamente en la detecció n de la producció n de betalactamasa (estrategia recomendada en procedimientos de otros países); debe estudiarse la sensibilidad a ampicilina, preferiblemente por té cnicas que permitan determinar la CMI, como la microdilució n o el Etest. Otro aspecto relevante y característico de las cepas procedentes de pacientes con FQ es la alta prevalencia (que puede llegar hasta el 20%) de aislados resistentes (CMI41 mg/ml) a fluoroquinolonas, hecho extremadamente infrecuente fuera del contexto de esta enfermedad 19 . Es recomendable la determinació n de la CMI (Etest o microdilució n) para ciprofloxacino u otras fluoroquinolonas o la detecció n de la posible pé rdida de sensibilidad a las fluroquinolonas con un disco de á cido nalidíxico.

Hasta la fecha no hay recomendaciones específicas en cuanto al mé todo má s adecuado para el estudio de la sensibilidad a antibió ticos de B. cepacia complex, S. maltophilia, A. xylosoxidans u otros bacilos gramnegativos no fermentadores en el contexto de la FQ y, por lo tanto, debe seguirse la metodología habitualmente utilizada en cada laboratorio (difusió n con discos, Etest o microdilució n). Es importante considerar que estos microorganismos se caracterizan por presentar de forma natural resistencia a muchos de los antibió ticos convencionalmente utilizados para el tratamiento de las infecciones por bacilos gramnegativos, y que esta resistencia es todavía mucho mayor en el contexto de la FQ. En la mayoría de los casos presentará n resistencia a todas las penicilinas, cefalosporinas, carbapenemes (todavía presentan cierta actividad frente a A. xylosoxidans), aminoglucó sidos, ciprofloxacino e incluso a antibó ticos de ú ltimo recurso, como las polimixinas. Por el contrario, frecuentemente pueden ser sensibles a otros antibió ticos de uso infrecuente en el tratamiento de las infecciones por bacilos gramnegativos y, generalmente, no evaluados de forma sistemá tica. Entre ellos, se encuentra el cotrimoxazol, la minociclina o las nuevas fluoroquinolonas; antibió ticos que deben ser específicamente estudiados en caso de aislamiento de estos microorganismos. El cotrimoxazol, de hecho, se considera el tratamiento de elecció n en las infecciones por S. maltophilia, aunque la prevalencia de cepas resistentes procedentes de pacientes con FQ está aumentado notablemente. Por el contrario, todas las cepas estudiadas hasta la fecha son uniformemente sensibles a la minociclina. Las nuevas fluoroquinolonas, como el levofloxacino y el moxifloxacino, mejoran sustancialmente la actividad del ciprofloxacino, y pueden resultar una opció n terapé utica de utilidad. Particularmente en el caso de B. cepacia, la limitació n de las opciones terapé uticas frecuentemente hace necesario recurrir a la bú squeda de sinergias entre 2 o incluso 3 antimicrobianos; diversas combinaciones del meropenem, la tobramicina, el cotrimoxazol, el moxifloxacino o la rifampicina se han utilizado con este propó sito.

El estudio está ndar de sensibilidad a los antimicrobianos en el laboratorio de microbiología se realiza con un inó culo preparado a partir de microorganismos previamente crecidos hasta fase exponencial o a partir de colonias aisladas en placas de cultivo de 24-48 h (NCCLS-M7A6). Este inó culo se denomina de crecimiento planktó nico en contraposició n al que se prepara a partir de bacterias desarrolladas en biopelículas o de crecimiento sé sil. Este ú ltimo se asemeja má s al crecimiento que se produce en el pulmó n del paciente con FQ. De hecho, diferentes autores han señ alado que las discrepancias en la respuesta al tratamiento con los resultados que se obtienen en los estudios de sensibilidad podrían deberse a que é stos se realizan con un crecimiento inadecuado de los microorganismos.

Dentro de la complejidad que presenta el estudio de sensibilidad en biopelículas los protocolos que má s se han utilizado son los que han derivado del dispositivo descrito por Ceri et al 37 , conocido como sistema de Calgary. El crecimiento de las bacterias se realiza en placas de microtitulació n, idé nticas a las que se utilizan para el estudio de sensibilidad por microdilució n, cerradas con unas tapas que contienen pú as (o pinchos) que se insertan en cada uno de los pocillos y sobre los que se desarrolla el biofilm. Una modificació n de este sistema ha sido empleado por Moskowitz et al 38 para el estudio de sensibilidad de P. aeruginosa procedentes de muestras respiratorias de pacientes con FQ y ha servido tambié n como modelo para S. pneumoniae 22 . Esta modificació n permite obtener un pará metro de actividad antimicrobiana, quizá má s representativo para el tratamiento de la infecció n cró nica que la propia CMI, denominado concentració n inhibitoria de biopelículas (CIB).

Casi todos los trabajos en los que se ha valorado la utilidad y las recomendaciones para la interpretació n de los cultivos microbioló gicos se han realizado para P. aeruginosa. La utilizació n de cultivos secuenciales de las secreciones respiratorias en los pacientes con FQ permite conocer el patró n de colonizació n y definir el estadio de colonizació n broncopulmonar en el que se encuentra el paciente (primocolonizació n, colonizació n intermitente, colonizació n cró nica) y confirmar, desde el punto de vista microbioló gico, la presencia de exacerbaciones. Asimismo, la realizació n de recuentos bacterianos en el cultivo facilita la medició n de la respuesta al tratamiento en los pacientes con colonizació n cró nica y documenta las exacerbaciones. Aunque hay controversias al respecto, el incremento de los recuentos bacterianos y el aumento del nú mero de morfotipos de P. aeruginosa se han relacionado con un deterioro de la funció n pulmonar. Tambié n se ha evidenciado en los pacientes con colonizació n por S. maltophilia. En la tabla 2 se recogen, de manera sinté tica, las definiciones realizadas por el Grupo Españ ol de Consenso del Tratamiento Antimicrobiano en el Paciente con Fibrosis Quística y los criterios microbioló gicos establecidos en la colonizació ninfecció n pulmonar por P. aeruginosa 39 . Su objetivo es la clasificació n de los pacientes para establecer pautas de tratamiento antimicrobiano. Por el momento no hay criterios publicados que definan los estadios de colonizació n por otros pató genos.

La identificació n correcta de B. cepacia probablemente es uno de los aspectos má s relevantes en el control microbioló gico de los pacientes con FQ. El fallo en el reconocimiento de este importante pató geno puede tener notables consecuencias en la evolució n clínica del paciente, mientras que la falsa identificació n de otros microorganismos, como B. cepacia, conlleva tambié n un elevado impacto mé dico, social y psicoló gico. Asimismo, la importancia clínica de las diferentes variedades genó micas no es la misma por la que se debería realizar la identificació n de la variedad dentro del complejo B. cepacia. Cuando se aísla este pató geno, debe informarse lo má s rá pidamente posible, y confirmar el resultado en un centro de referencia. Asimismo, se deben aplicar medidas de control estrictas, particularmente es necesario separar a estos pacientes de otros no colonizados para evitar la transmisió n cruzada. Se recomienda tambié n mantener separados entre sí a los pacientes colonizados por B. cepacia, para evitar la transmisió n de cepas particularmente virulentas.

El informe del laboratorio de microbiología para las muestras respiratorias de pacientes con FQ debe incluir la identificació n y el recuento (logaritmo de ufc/ml de esputo) de todos los microorganismos potencialmente pató genos presentes, y su antibiograma correspondiente. En el caso de P. aeruginosa, se debe especificar el nú mero de morfotipos distintos presentes y se debe incluir un antibiograma para cada uno de ellos. Particularmente, debe especificarse, en su caso, la presencia de cepas con morfotipo mucoso. En el informe del antibiograma se debe aplicar, como en cualquier otro tipo de infecció n, los puntos de corte establecidos para la administració n de los antibió ticos por vía sisté mica; tambié n es recomendable aplicar puntos de corte específicos para la vía inhalada. Actualmente, só lo hay recomendaciones específicas para la tobramicina, que es el antibió tico má s frecuentemente usado como terapia de mantenimiento por vía inhalatoria en los pacientes con FQ 35 . Los puntos de corte establecidos indican considerar como potencialmente tratables por esta vía las cepas cuya CMI de tobramicina sea p64 mg/ml (puntos de corte convencionales del CLSI p4 mg/ml sensible).

En funció n de la experiencia de cada centro, los estudios de sensibilidad convencionales pueden completarse con la determinació n de otros pará metros descritos en apartados anteriores: determinació n de la concentració n inhibitoria de biopelículas (CIB) y la concentració n inhibitoria de mutantes (CPM). Si bien estos pará metros no pueden sustituir, hoy por hoy, a la CMI clá sica, pueden aportar informació n complementaria ú til en la selecció n de los regímenes antibió ticos má s adecuados para el tratamiento de la infecció n cró nica por P. aeruginosa. De igual forma, sería recomendable realizar e informar los estudios de sinergia en las cepas multirresistentes.

Asimismo, en funció n de la experiencia de cada centro, debe valorarse la detecció n de cepas hipermutadoras y, en su caso, informar de su aislamiento y añ adir en las observaciones del informe una llamada a la necesidad de utilizar combinaciones de antibió ticos para su tratamiento debido al elevado riesgo de desarrollar resistencia. Una de las cuestiones má s relevantes que surgen al examinar los antibiogramas de las cepas hipermutadoras es có mo interpretar e informar los resultados de sensibilidad por la frecuente presencia de SMR. La aproximació n má s conservadora sería considerar las subpoblaciones resistentes y leer las CMI (Etest) o diá metros de los halos de inhibició n (difusió n con discos) que producen una completa inhibició n del crecimiento. El problema de esta consideració n es que en muchos Pueden aparecer cepas con colonias mucosas y otros morfotipos coloniales

Colonizació n inicial con infecció n broncopulmonar Se utilizan los mismos criterios microbioló gicos que en la colonizació n inicial o esporá dica Aparició n de signos clínicos o inmunoló gicos de infecció n Suelen ser cepas con colonias no mucosas, con escasa diversidad de morfotipos y sensibles a antimicrobianos. En pacientes sin estudio microbioló gico puede utilizarse como criterio diagnó stico la aparició n o el aumento de anticuerpos en dos muestras de sangre sucesivas separadas al menos por 3 meses Colonizació n cró nica Cultivos positivos persistentes de P. aeruginosa: detecció n, en un período de 6 meses, de al menos 3 cultivos positivos para P. aeruginosa en muestras separadas entre sí, al menos, 1 mes Ausencia de nuevos signos clínicos de infecció n pero con respuesta inmunitaria consistente con la presencia de P. aeruginosa

Suele producirse por cepas con colonias mucosas y otros morfotipos coloniales. Es el patró n habitual en períodos avanzados de la enfermedad Infecció n broncopulmonar cró nica (exacerbació n)

Se utilizan los mismos criterios microbioló gicos que en la colonizació n cró nica Signos clínicos de exacerbació n o con respuesta inmunitaria incrementada durante la colonizació n cró nica En pacientes sin estudio microbioló gico puede utilizarse como criterio diagnó stico el aumento de anticuerpos en dos muestras de sangre sucesivas casos informaríamos la cepa como resistente a todos los antibió ticos (incluso aunque no presente mecanismos de resistencia adquiridos) y, por lo tanto, no habría ninguna opció n terapé utica disponible. Sin embargo, los estudios de sinergia demuestran que las SMR desaparecen cuando se utilizan combinaciones de antibió ticos con distinto mecanismo de resistencia. Resulta importante distinguir la verdadera resistencia de la debida a la presencia de SMR producida por la propia frecuencia de mutació n incrementada, ya que al contrario de lo que ocurre con el primer tipo de resistencia, el segundo podría ser potencialmente combatido con combinaciones de antibió ticos. En este sentido, recientemente se ha propuesto una alternativa para la interpretació n de los antibiogramas (difusió n con discos y Etest) de las cepas hipermutadoras 33, 36 : a) leer las CMI (o diá metros de los halos de inhibició n) de la població n general y aplicar los puntos de corte definidos para las categorías de sensibilidad (S, I, R), y b) examinar la presencia de SMR y leer las CMI o diá metros de los halos de inhibició n producidos por el crecimiento de é stas y aplicar los puntos de corte definidos para las categorías de sensibilidad (S, I, R). La lectura definitiva de las SMR puede requerir 12-24 h adicionales de incubació n en las cepas de lento crecimiento. Informar de los antibió ticos para los cuales la població n general es sensible, pero que contiene SMR que supera los puntos de corte como )resistente, pero potencialmente activo para su uso en terapia combinada*.

Té cnicas rá pidas de diagnó stico Detección de P. aeruginosa y otros patógenos en muestras respiratorias por métodos moleculares El cultivo es la té cnica utilizada habitualmente para detecció n de P. aeruginosa y otros bacilos gramnegativos. Sin embargo, en ocasiones el cultivo es negativo (especialmente en pacientes con tratamiento antimicrobiano o con baja carga bacteriana) o se requieren varios días para llegar a la identificació n. Por eso, cada vez es má s frecuente la utilizació n de té cnicas moleculares que permiten un diagnó stico má s rá pido y con menor límite de detecció n 40 .

La amplificació n mediante PCR de los genes ribosomales, la posterior secuenciació n y comparació n con bases de datos, permite identificar prá cticamente todos los microorganismos y ha permitido identificar nuevas especies. En los ú ltimos añ os se ha utilizado con é xito la té cnica de FISH (fluorescent in situ hybridization) para detecció n de los principales pató genos en pacientes con FQ (P. aeruginosa, S. aureus, H. influenzae, B. cepacia, Burkholderia spp. y S. maltophilia). La té cnica permite obtener resultados en pocas horas y se ha descrito muy buena especificidad, pero sensibilidad del 90%, comparada con el cultivo, ya que requiere alta densidad de colonizació n para dar un resultado positivo.

Las té cnicas de PCR utilizadas para detectar P. aeruginosa en esputo de pacientes con FQ presentan, en general, alta sensibilidad (del 93 al 100% segú n los primers que se utilicen) 40 . Entre los genes utilizados como diana encontramos el ARNr 16S, oprI y oprL, algD o el gen de la exotoxina A (ETA). Uno de los genes má s utilizados, oprI, está muy conservado entre los diferentes miembros de Pseudomonas, y el gen oprL es específico de P. aeruginosa, incluidas las colonias no pigmentadas y las mucoides. Por lo tanto, es posible realizar una PCR mú ltiple que detectará P. aeruginosa y otras Pseudomonas en la misma reacció n. La té cnica aplicada a muestras clínicas muestra una alta sensibilidad, ya que es capaz de detectar 100 ufc/ml. Estas té cnicas permiten, ademá s, detectar colonizació n con P. aeruginosa una media de 4,5 meses antes que el cultivo.

Las té cnicas moleculares tambié n se han utilizado con é xito para detectar B. cepacia complex a partir de muestras respiratorias de pacientes con FQ, mediante diferentes primers diseñ ados para amplificar el gen recA, regiones conservadas del gen 16S ARNr, o la regió n espaciadora 16S a 23S 41, 42 . Los primeros estudios se realizaron con los primers para el 16S ARNr; sin embargo, estos primers estaban diseñ ados frente a una cepa de B. cepacia de la variedad genó mica I y actualmente se sabe que tienen baja especificidad para B. multivorans y B. vietnamiensis y, ademá s, pueden tener reacció n cruzada con otras bacterias distintas de B. cepacia complex. Los primers de la regió n espaciadora 16S-23S permiten identificar só lo 3 variedades genó micas (B. cepacia, B. cenocepacia y B. stabilis) por lo que no son ú tiles para detectar todas las cepas del complejo. Los primers del gen recA permiten detectar bacterias del complejo B. cepacia con alta especificidad y posteriormente identifican las diferentes variedades genó micas por RFLP 41 . De hecho, los casos descritos de PCR negativa y cultivo positivo para B. cepacia resultaron ser cepas de Burkholderia pero no del complejo cepacia. El mé todo es poco sensible, pues necesita 10 6 ufc/g de esputo para dar un resultado positivo, debido a que se amplifica un fragmento relativamente grande (para poder obtener patrones diferentes de digestió n) y en el genoma de B. cepacia hay una ú nica copia del gen recA. El límite de detecció n es má s bajo cuando se usan los primers de la regió n espaciadora del 16S-23S, debido a que en el genoma hay mú ltiples copias del operó n ARNr. Sin embargo, a pesar de que el límite de detecció n por gramo de esputo es alto, los resultados clínicos son excelentes y muestra una muy buena correlació n con los datos obtenidos por cultivo.

Técnicas para el estudio directo de la sensibilidad y la resistencia a los antibióticos En los ú ltimos añ os cada vez cobra má s interé s el desarrollo de procedimientos que permitan conocer la sensibilidad a antibió ticos directamente en la siembra primaria. La principal motivació n para esta aproximació n reside en que con los procedimientos convencionales hay un retraso importante en la obtenció n de los resultados, no menos de 2 ó 3 días despué s de la toma de muestra en el mejor de los casos, lo que limita enormemente el impacto positivo de la terapia dirigida, particularmente en las infecciones graves de rá pida evolució n. Segú n estudios recientes, la realizació n de un antibiograma por Etest directamente de las muestras respiratorias de los pacientes con neumonía relacionada con ventilació n mecá nica ofrece resultados en 18-24 h prá cticamente concordantes en su totalidad con el antibiograma convencional. En primera instancia cabría suponer que la disminució n del tiempo necesario para la obtenció n de los resultados no debe ser aparentemente una prioridad imperiosa en el contexto de la colonizació n-infecció n cró nica en pacientes con FQ, y que por tanto no estaría justificada esta aproximació n. No obstante, existe otra connotació n que quizá abogue a favor del estudio directo de sensibilidad: la gran heterogeneidad poblacional en las infecciones cró nicas. Esta marcada heterogeneidad obliga al estudio individual de cada uno de los morfotipos presentes en las muestras (ya que frecuentemente presentan diferente sensibilidad), con el aumento notable del coste y la complejidad del procedimiento; es má s, ello no garantiza la detecció n de poblaciones resistentes, ya que colonias pertenecientes al mismo morfotipo tambié n podrían presentar distinto perfil de resistencia a antimicrobianos. Principalmente son dos las té cnicas propuestas para este fin, el Etest directo y la siembra en medios con antibió ticos 43 . Si bien sus potenciales prestaciones son prometedoras, no está n suficientemente validadas por estudios comparativos y por eso ninguna de ellas puede sustituir actualmente al procedimiento convencional, aunque pueden ofrecer resultados complementarios de utilidad.

Técnicas moleculares para la identificación de bacilos gramnegativos no fermentadores Como se ha comentado anteriormente, la identificació n de B. cepacia y otros bacilos gramnegativos no fermentadores requiere de té cnicas moleculares, ya que los mé todos fenotípicos no son suficientemente fiables y se puede realizar identificació n incorrecta de bacterias con alta trascendencia clínica, como P. aeruginosa o, sobre todo, B. cepacia.

La té cnica molecular definitiva es la secuenciació n, que permite identificar cualquier bacteria comparando la secuencia en la base de datos o incluso permite identificar bacterias nuevas. La comparació n de la secuencia del gen ARNr 16S se ha usado como prueba de referencia en estudios filogené ticos de bacterias; sin embargo, la resolució n puede ser demasiado baja para distinguir especies muy relacionadas. Tambié n se ha utilizado la secuencia del gen gyrB como complementaria a la del ARNr para identificar algunas bacterias como Pandoraea spp.

Si la secuenciació n no está disponible, se puede realizar el patró n de restricció n del fragmento amplificado (PCR-RFLP) o el polimorfismo de la conformació n de la cadena simple (SSCP), que puede ser analizado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante o electroforesis capilar. La té cnica de ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction analysis), en la que se amplifica el gen y posteriormente se realiza una digestió n con enzimas de restricció n, ha demostrado ser una alternativa a la secuenciació n para diferenciar, por ejemplo, Inquilinus spp. o Pandoraea spp. de otros bacilos gramnegativos no fermentadores.

La té cnica de AFLP (amplified fragment length polymorphism) convencional puede ser ú til para identificar B. cepacia, pero es té cnicamente compleja. La PCR en tiempo real está accesible en muchos laboratorios clínicos, pero no es ú til para detectar cualquier microorganismo presente, sino que se utiliza para identificar un gé nero o especie segú n la amplificació n de un gen específico 42 . Se han estudiado diferentes dianas y la mejor identificació n, especialmente en la identificació n de P. aeruginosa atípicas, se consigue cuando se detectan varios genes simultáneamente.

La determinació n de las variedades genó micas de B. cepacia se basa en un estudio taxonó mico complejo que incluye pruebas fenotípicas, como el perfil de proteínas totales, y genotípicas, como hibridació n ADN-ADN. Recientemente, se está n utilizando con é xito las pruebas basadas en PCR para identificar las variedades genó micas, principalmente basadas en el gen ARNr 16S o en el recA 41, 42 . La amplificació n del gen ARNr 16S, y posterior aná lisis mediante secuenciació n o con enzimas de restricció n, tiene un uso limitado para diferenciar las variedades genó micas, ya que no presenta suficiente variabilidad. El estudio del gen recA se puede afrontar desde diferentes estrategias que dependerá n de la disposició n de medios en cada centro: a) amplificació n del gen con primers específicos que permite identificar un aislamiento como perteneciente al complejo B. cepacia; b) digestió n del fragmento amplificado con HaeIII y con MnlI que permite clasificarlos dentro de las principales variedades; c) PCR específica de cada variedad de forma individualizada, y d) secuenciació n del fragmento amplificado, que permite la identificació n y la clasificació n precisa.

Técnicas de epidemiología molecular para el seguimiento de la colonización-infección broncopulmonar crónica La aplicació n de las té cnicas de tipificació n molecular puede contribuir de manera notable a la optimizació n del seguimiento microbioló gico de la infecció n-colonizació n cró nica por P. aeruginosa en pacientes con FQ. La electroforesis en campo pulsado (ECP), como para la mayoría de los microorganismos, es la té cnica de referencia, aunque aquellas basadas en la PCR (REP, AP, ERIC o RAPD, entre otras) pueden resultar, por su rapidez y sencillez, má s fá cilmente adaptables al trabajo sistemá tico del laboratorio de microbiología.

Una de las principales aportaciones de las té cnicas de tipificació n molecular es su utilidad para el propio diagnostico de la infecció n-colonizació n cró nica. Como se ha comentado en apartados anteriores, los primeros estadios del proceso suelen cursar con aislamiento esporá dico o intermitente de P. aeruginosa; la tipificació n molecular puede permitir determinar si realmente se trata ya de una colonizació n cró nica, todavía con baja carga bacteriana, o si por el contrario se trata ú nicamente de colonizaciones esporá dicas por cepas ambientales diferentes. De igual forma, las té cnicas de tipificació n molecular pueden resultar de gran utilidad para la evaluació n de la eficacia de los tratamientos erradicadores iniciales. Si bien es factible conseguir en estos primeros estadios la negativizació n de los cultivos por un periodo má s o menos prolongado, es frecuente que al cabo de los meses se vuelva a documentar cultivos positivos: la tipificació n molecular nos permitirá determinar si nos enfrentamos a una falsa erradicació n (la cepa original persistió en densidades por debajo del umbral de detecció n) o si, por el contrario, nos encontramos ante una nueva colonizació ninfecció n por otra cepa diferente (y por lo tanto el tratamiento erradicador fue efectivo) 39 .

En los ú ltimos añ os se ha documentado la diseminació n epidé mica de cepas concretas de P. aeruginosa entre los pacientes con FQ 7 . El primer clon epidé mico fue originalmente descrito en 1995 en Liverpool (LES, Liverpool epidemic strain) y actualmente se encuentra diseminado por todo el Reino Unido. De igual forma, se ha descrito una notable transmisió n de clones epidé micos entre pacientes con FQ en Australia. Finalmente, en un estudio reciente se documenta la transmisió n cruzada entre pacientes con FQ de dos clones concretos mayoritarios durante má s de dos dé cadas en Dinamarca; estos clones aparentemente estarían adaptados no só lo para producir infecció n cró nica, sino tambié n para transmitirse de forma eficiente entre los pacientes con FQ. Frecuentemente, ademá s, estos clones epidé micos son resistentes a mú ltiples antibió ticos y su aislamiento conlleva un peor pronó stico de la infecció n cró nica. Por lo tanto, es recomendable mantener una vigilancia activa para la detecció n y la contenció n de clones potencialmente epidé micos.

Diagnóstico serológico en el contexto de la FQ La diferenciació n entre colonizació n, infecció n y enfermedad no es fá cil de establecer en el caso de algunos de los microorganismos oportunistas que afectan de forma cró nica a los pacientes con FQ. En determinados casos es importante detectar cuanto antes la infecció n inicial ya que el tratamiento antibió tico precoz es ú til para evitar el establecimiento de la infecció n cró nica antes de que sea imposible erradicarla. En otros casos, la distinció n entre colonizació n e infecció n, aunque difícil, puede establecerse segú n criterios basados en la frecuencia o la persistencia de su aislamiento. El diagnó stico de enfermedad activa o deterioro pulmonar atribuible a ellos es muy difícil en estos pacientes basado en criterios clínicos, funcionales o radioló gicos porque prá cticamente todos los pacientes con FQ presentan alteraciones debidas a la propia enfermedad. En este contexto, el estudio de la respuesta de anticuerpos específicos contra microorganismos, como Aspergillus, P aeruginosa o MNT, es un complemento ú til para la detecció n precoz de la colonizació n, la diferenciació n entre infecció n y enfermedad activa, como marcador pronó stico, para la toma de decisiones terapé uticas o, en algú n caso, para el seguimiento de la respuesta al tratamiento 33 . En el caso de Aspergillus, la presencia de anticuerpos específicos es un criterio fundamental, aunque no suficiente, para confirmar o excluir el diagnó stico de ABPA 30 . Estudios longitudinales de pacientes con FQ desde el nacimiento han mostrado que la detecció n de anticuerpos específicos anti-P. aeruginosa puede preceder entre 3 y 24 meses al primer aislamiento por cultivo. Una vez aislada por primera vez, los títulos elevados o su aumento pueden preceder hasta en 3 añ os a la instauració n de la infecció n cró nica 44 . La detecció n de anticuerpos contra P. aeruginosa sería ú til para el diagnó stico de la infecció n inicial por este microorganismo, sobre todo cuando no es posible la obtenció n de muestras adecuadas para cultivo, principalmente en niñ os muy pequeñ os 45 .

Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis

Cystic Fibrosis Foundation, Patient Registry Annual Report. Bethesda, Maryland

Lung infections associated with cystic fibrosis

Update on pathogenesis of cystic fibrosis lung disease

Microbiology of airway disease in patients with cystic fibrosis

En: Dapena Ferná ndez FJ, editor. Fibrosis quística: atenció n integral. Manejo clínico y puesta al día. Granada: Alhuila

Evolving epidemiology of Pseudomonas aeruginosa and the Burkholderia cepacia complex in cystic fibrosis lung infection

Evolution of Pseudomonas aeruginosa pathogenicity: from acute to chronic infections

Pulmonary outcome in cystic fibrosis is influenced primarily by mucoid Pseudomonas aeruginosa infection and immune status and only modestly by genotype

Genetic adaptation by Pseudomonas aeruginosa to the airways of cystic fibrosis patients

High frequency of hypermutable Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis lung infection

Efficacy and potential for resistance selection of anti-pseudomonal treatments in a mouse model of lung infection by hypermutable Pseudomonas aeruginosa

Hypermutation is a key factor in development of multiple-antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa strains causing chronic lung infections

Staphylococcus aureus escapes more efficiently from the phagosome of a cystic fibrosis bronchial ephitelial cell line than from its normal counterpart

High rate of macrolide resistance in Staphylococcus aureus strains from patients with cystic fibrosis reveals high proportions of hypermutable strains

Persistent infection with small colony variant strains of Staphylococcus aureus in patients with cystic fibrosis

Cumitech 43, Cystic fibrosis microbiology

Multiple Haemophilus influenzae strains and strain variants coexist in the respiratory tract of patients with cystic fibrosis

Dynamics of longterm colonization of respiratory tract by Haemophilus influenzae in cystic fibrosis patients shows a marked increase in hypermutable strains

Fluoroquinolone resistance in Haemophilus influenzae is associated with hypermutability

Spanish Pneumococcal Infection Study Network. Population structure, antimicrobial resistance, and mutation frequencies of Streptococcus pneumoniae isolates from cystic fibrosis patients

Differences in biofilm development and antibiotic susceptibility among Streptococcus pneumoniae isolates from cystic fibrosis samples and blood cultures

Burkholderia cepacia complex: a contraindication to lung transplantation in cystic fibrosis?

Infection control in cystic fibrosis

Unusual respiratory bacterial flora in cystic fibrosis: microbiologic and clinical features

Cantó n R. Persistence and variability of Stenotrophomonas maltophilia in cystic fibrosis patients

Nontuberculous Mycobacteria. I: Multicenter prevalence study in cystic fibrosis

Age-related prevalence and distribution of nontuberculous mycobacteria species among patients with cystic fibrosis

Gó mez-Mampaso E. Nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis

Allergic bronchopulmonary Aspergillosis in cystic fibrosis-state of de art

Viral and atypical bacterial infections in the outpatients pediatric cystic fibrosis clinic

Diagnó stico microbioló gico de las infecciones bacterianas del tracto respiratorio inferior

En: Cercenado E, Cantó n R, editores. Procedimientos en Microbiología Clínica n. o 25. 2. a ed. Sociedad Españ ola de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC)

Comparison of two comertial systems (vitek and MicroScan-Walkaway) for antimicrobial susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients

Cantó n R. Breakpoints for predicting Pseudomonas aeruginosa susceptibility to inhaled tobramycin in cystic fibrosis patients: use of high-range Etest strips

Detection and susceptibility testing of hypermutable Pseudomonas aeruginosa strains with the Etest and disk diffusion

The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms

Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis

Spanish Consensus Group for Antimicrobial Therapy in the Cystic Fibrosis Patient. Antimicrobial therapy for pulmonary pathogenic colonisation and infection by Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis patients

Detection of Pseudomonas aeruginosa in patients with cystic fibrosis

DNA-based diagnostic approaches for identification of Burkholderia cepacia complex, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia multivorans, Burkholderia stabilis, and Burkholderia cepacia genomovars I and III

Identification of Burkholderia cepacia complex pathogens by rapid-cycle PCR with fluorescent hybridization probes

Recovery of antimicrobial-resistant Pseudomonas aeruginosa from sputa of cystic fibrosis patients by culture on selective media

Respiratory infections with Pseudomonas aeruginosa in children with cystic fibrosis. Early detection by serology and assessment of risk factors

Diagnostic value of serum antibodies in early Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis patients