key: cord-0039847-18ar90sx authors: Wilhelm, Nathalie; Fevrier, Frédéric; Le Coustumier, Alain; Grasmick, Claude title: Biologie moléculaire automatisée en microbiologie: quoi de neuf? date: 2005 journal: nan DOI: 10.1007/bf03013618 sha: e61c120135aae43a68c7366189deb5175eed624f doc_id: 39847 cord_uid: 18ar90sx De plus en plus de biologistes s’intéressent à la biologie moléculaire mais n’ont pas franchi le pas. Les automates d’extraction et de PCR en temps réel ainsi que les kits de réactifs simplifient et sécurisent de façon croissante la technique. Cet article présente les évolutions récentes dans ce domaine. pr~-traitement de ces ~chontillons pour permettre une extraction de qualit~ : broyoge fin des tissus, centrifugation, lyse ~ temperature ~lev~e sous conditions hautement d~noturantes en presence de prot~ose ou prot~inose K et de tampon contenont des sels chaotropes. Ces sels (de guonidinium le plus souvent) favorisent Hadsorption des ocides nucl~iques sur la phase solide. Les syst~mes de PCR en temps r~el permettent de r~aliser simulto-n~ment et dons Io m~me cupule r~octionnelle l'omplificotion des ocides nucl~iques et leur d~tection, lls jouent le r61e de thermocycleur tr~s performant mais oussi celui de fluorom@tre qui quontifie le produit d'amplification (amplicon) en temps r~el. Le principe de Io PCR quantitative en temps re~el repose sur le suivi cycle par cycle de la r~action d'amplification par I'augmentation de I'intensit~ de fluorescence ~mise. La courbe intensit~ de fluorescence par rapport ou temps obtenue se divise en 3 phases : la phase d'initiotion pendant laquelle oucun signal n'est mesurable, Io phase exponentielle, et la phase plateau. La phase exponentielle est Io seule phase pendant Ioquelle l'efficocit~ d'omplification est suppo-s~e rester constante. Le point de d~port de cette phase est appel~ cycle seuil optique ou <>, inversement proportionnel ou logarithme du nombre de mol~cules d'acide nucl~ique cible pr~sentes event amplification. Lo d~tection peut se foire 5 l'aide d'un ~ent intercdant, le SyBRT"Green I, qui se lie pr~f~rentiellement ~ I'ADN double brin nouvellement synth~-tis~. Ce syst~me est simple et peu co~teux mais manque de specificitY. En effet, l'ogent interealont se lie oussi avee des dim~res de <> ou des produits de PCR non sp~cifiques. II importe olors de r~aliser une n°1, 1 4 1 courbe de fusion post-PCR puis de determiner Io temperature de fusion des produits amplifies. La detection des omplicons peut aussi se loire l'oide de sondes fluorog~niques, synthEtisEes ~ Io demande par les lubricants. Elles sont spEcifiques d'un fragment de l'acide nuclEique amplifie et sont couplEes 6 un fluorophore d'un c6tE et ~ un absorbeur de fluorescence de l'autre. Les principaux types de sondes utilisEes sont les sondes d'hydrolyse ou sondesTaqman TM, les sondes FRET " (sondes en tandem), les bolises molEculaires ou en Epingles ~ cheveux (Molecular Beacon) et leur varionte (les sondes scorpion). De part leur spEcificitE, elles sont de plus en plus utilisEes en diagnostic medical et tendent supplanter le SyBR%reen I mQlgrE leur co~t. Le degrE d'outomatisation de la phase d'extraction est variable selon les syst~mes. Avec le semi-automate miniMAG (bioM~rieux), l'opErateur ~joute encore manuellement les diffErents tampons (lyse, lavages, Elution). Les outres syst~mes prEsentEs sont entiErement Pray L New Thermocyclers hit the street 0uantificatian des acides nucl~iques par PER quantitative en temps r~el PCR based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acute-care settings La PCR en temps r~el : principe et applications Biologie mol~culaire et Bacteriologic