key: cord-0039394-ihkqauve
authors: nan
title: PCR-Analytik
date: 2005
journal: Praktikum der Molekulargenetik
DOI: 10.1007/3-540-26469-8_4
sha: b5ea888de98bc0e491532bdb369339119c110294
doc_id: 39394
cord_uid: ihkqauve

nan

Die PCR als sensitivste Methode zum Nukleinsäurenachweis hat sich seit ihrer Entstehung in kürzester Zeit in allen Bereichen der biologischen Forschung verbreitet und fi ndet auch darüber hinaus breite Anwendung. Eine Beschreibung der vielfältigen Einsatzmöglichkeiten der PCR in der Grundlagenforschung würde den Rahmen dieses Kapitel sprengen, hier sei auf weiterführende Literatur verwiesen. Zwei häufi ge Anwendungen, nämlich der Nachweis von Fremd-DNA in der genomischen DNA eines Organismus nach einer Transformation und der Nachweis eines prozessierten Transkripts mittels RT-PCR, werden im Experimentalteil dieses Kapitels beschrieben.

Einen Eine weitere Variation der PCR ist die RAPD (random amplifi ed polymorphic DNA)-PCR. Dies ist eine Methode zur Detektion von Genom-Polymorphismen und damit zur Unterscheidung von genetisch nicht identischen Organismen. Die Methode beruht darauf, dass eine PCR unter wenig stringenten Bedingungen mit kurzen Primern (ca. 10 nt) und der genomischen DNA der zu untersuchenden Organismen durchgeführt wird. Unter solchen Bedingungen (z. B. bei relativ niedrigen Annealing-Temperaturen) können die Primer auch an Sequenzen binden, zu denen sie nicht vollständig homolog sind. In folgenden Zyklen können dann die amplifi zierten Fragmente, die an ihren Enden die spezifi schen Primer-Sequenzen aufweisen, bevorzugt amplifi ziert werden. Bei einer anschließenden Gelelektrophorese bilden diese Fragmente dann deutliche Banden. Das Bandenmuster ist dabei charakteristisch für ein Individuum. Diese Methode kann z. B. zur Unterscheidung von morphologisch identischen, aber genetisch verschiedenen Stämmen dienen.

Eine spezielle Anwendung der PCR ist die RT-PCR-Methode, mit der RNA-Transkripte nachgewiesen werden können. Als Ausgangsmaterial für die PCR dient dabei ein cDNA-Gemisch, welches zuvor mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase aus RNA synthetisiert wurde. Die Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die RNA als Matrize für die Synthese eines DNA-Stranges benutzt. Als Primer zur cDNA-Synthese werden meist kurze Oligonukleotide aus sechs Basenpaaren (Hexamere) verwendet, die aus vielen möglichen Sequenzen bestehen und an zufälligen Stellen der RNA hybridisieren. Der Start der cDNA-Synthese erfolgt somit an vielen Stellen der RNA. Zur Untersuchung der Transkripte proteinkodierender Gene im Kern von Eukaryoten können auch Oligo-dT-Primer eingesetzt werden, die komplementär zu den poly(A)-Enden der reifen Transkripte sind. Sie ermöglichen die reverse Transkription vom 3'-Ende der Transkripte. Die gewonnene cDNA dient dann als Matrize für die PCR-Reaktion, in der mit Hilfe von spezifi schen Oligonukleotidprimern das gewünschte Fragment amplifi ziert wird. Werden die PCR-Primer so gewählt, dass sie ein Intron eingrenzen, so weist das aus der cDNA amplifi zierte PCR-Fragment im Vergleich zur DNA-Kontrolle eine kleinere Fragmentgröße auf, da die cDNA aus der intronfreien RNA synthetisiert wurde. Anhand der Größenunterschiede können so mögliche DNA-Kontaminationen identifi ziert und das gewünschte Transkript nachgewiesen werden.

Viele Methoden zur Erforschung bestimmter Aspekte der Transkription enthalten RT-PCR-Schritte. Auf RT-PCR basiert unter anderem RACE (rapid amplifi cation of cDNA ends), eine Methode zur Bestimmung des 5'-oder 3'-Endes von Transkripten. Ebenfalls auf RT-PCR basierend sind verschiedene Methoden zur Quantifi zierung von Transkriptmengen bzw. zur Identifi kation differentiell exprimierter Gene. Hierzu gehören unter anderem Differential Display, SAGE (serial analysis of gene expression) und SSH (suppression subtractive hybridization). Für weiterführende Informationen sei auf die vielfältige Fachliteratur zu diesem Thema verwiesen.

Bei der Real-Time-PCR handelt sich um eine recht neue Methode der quantitativen PCR, bei der die Menge des entstehenden PCR-Produkts nach jedem PCR-Zyklus gemessen wird, daher der Name. (Teilweise wird diese PCR-Methode auch als RT-qPCR für Real-Time-quantitative-PCR oder, in 

In den im Folgenden beschriebenen Experimenten werden typische Anwendungsmöglichkeiten der PCR-Methode vorgestellt. Dabei handelt es sich zum einen um den Einsatz der PCR beim Nachweis von Fremd-DNA in transgenen Organismen, während im zweiten Teil die RT-PCR zum Nachweis eines intronfreien Transkriptes verwendet wird. Die Methoden können als Ersatz bzw. Ergänzung zu Southern und Northern Blots verwendet werden. Alle Reaktionen werden in PCR-Automaten durchgeführt. Die Syntheseprodukte werden anschließend durch eine Gelelektrophorese überprüft.

Die hier vorgestellten Experimente sind für die Verwendung mit den angegebenen Enzymen (Reverse Transkriptase, Taq-Polymerase) und PCR-Geräten optimiert. Bei Verwendung anderer Reagenzien oder Geräte müssen eventuell Anpassungen der Reaktionsparameter vorgenommen werden. In den Versuchen werden exemplarisch der Hyphenpilz S. macrospora, die Blütenpfl anze A. thaliana und die Taufl iege D. melanogaster untersucht, die vorgestellten Experimente lassen sich aber problemlos auch auf andere Organismen und Fragestellungen übertragen.

In diesem Versuch soll die PCR dazu dienen, transgene Organismen zu untersuchen. Exemplarisch wird die Integration von Fremd-DNA in das Genom des Hyphenpilzes Sordaria macrospora nachgewiesen. Es soll nach Transformanten gesucht werden, bei denen das ura3-Gen von S. macrospora mittels homologer Rekombination durch eine inaktivierte Kopie ersetzt wurde. Grundsätzlich dienen derartige Transformationen zur Erzeugung von defi nierten "Gene-Disruption"-oder "Gene-Knockout"-Mutanten, die für die Analyse von Genfunktionen von großer Bedeutung sind.

Die PCR-Methode kann hier eine Überprüfung der transgenen Organismen durch Southern-Hybridisierung ersetzen. Ein Nachteil ist zwar, dass man keine weiteren Informationen über die Art der Plasmid-Integration wie Anzahl und Verteilung der integrierten Kopien erhält; ein Vorteil ist jedoch die Effizienz, mit der eine Überprüfung erfolgen kann. Diese Methode ist besonders schnell und wenig arbeitsaufwändig, da sie nicht die Isolation großer DNA-Mengen notwendig macht. Für die PCR-Analytik ist die aus einer Schnellisolierung erhaltene DNA-Menge in der Regel ausreichend.

Der 

Ein einfacher und sicherer Nachweis für die stabile Integration der durch Agrobakterien übertragenen DNA in das Genom von Arabidopsis thaliana (Kap. 3.5) ist die Amplifi kation eines T-DNA-spezifi schen Genabschnittes mittels Polymerasekettenreaktion (PCR). Die hier angegebene PCR kann der Vervielfältigung eines Teils des Kanamycin-Resistenzgens (Neomycin-Phosphotransferase, nptII) dienen und ist ein Beispiel für eine T-DNA-spezifi sche PCR-Reaktion. 

Agarose gelelektrophorese aufgetrennt.

Das gewünschte Fragment hat eine Länge von 676 bp und entsteht nur, wenn DNA der transgenen Pfl anze als Matrize eingesetzt wurde.

Mit der Methode der "inversen PCR" lassen sich unbekannte DNA-Sequenzen, die benachbart zu einer bekannten Sequenz liegen, amplifi zieren. 

Die inverse PCR führt möglicherweise zu mehreren Banden. Dies kann bedeuten, dass die Reaktionsbedingungen nicht stringent genug angesetzt worden sind, oder es zeigt, dass mehr als eine P-Element-Insertion im Genom vorliegt. Über eine Sequenzanalyse lässt sich dies in der Regel ermitteln, da in korrekten Amplifi katen neben der genomischen Sequenz auch P-Element-Sequenzen nachweisbar sein sollten. 

Zwei Wasserbäder auf 70 °C bzw. 42 °C einstellen, mit Thermometer im Wasser kontrollieren!

Zu 10 µL RNA (1 µg) ins Eppendorfgefäß pipettieren: 17 µL Wasser (2× autoklaviert) und 4 µL Oligonukleotid-Mix (Hexamere + Oligo-dT)

°C im Wasserbad inkubieren (Denaturierung von RNA-Sekundärstrukturen)

%) aufgetrennt. Abb. 4.5.5 zeigt das Ergebnis dieser RT-PCR: Von den Kontroll-DNAs (Wildtyp und p165.3) wird wie erwartet ein Fragment in der Größe der genomischen DNA (ca. 520 bp) amplifi ziert. Von dem Ansatz mit Reverser Transkriptase wird ebenfalls erwartungsgemäß ein cDNA-Fragment von ca. 440 bp amplifi ziert, während von der Kontrolle ohne Reverse Transkriptase sowie von der Kontrolle ohne Nukleinsäuren kein Amplifi kat erhalten wird

5× RT-Puffer 6,0 µL 6,0 µL dNTPs (10 mM) 1