key: cord-0035497-g46gs087 authors: nan title: DNA, RNA und IHRE Amplifikation date: 2009-12-24 journal: Bioanalytik für Einsteiger DOI: 10.1007/978-3-8274-2156-2_6 sha: 09f399d23fac6106e77c54767fa3984153604402 doc_id: 35497 cord_uid: g46gs087 DNA heißt die magische Helix des Lebens — der materielle Träger der Erbsubstanz, die Desoxyribonucleinsäure (DNA, deoxyribonucleic acid) (siehe Box 6.1). ■ 6.1 DNA: die Doppelhelix DNA heißt die magische Helix des Lebens -der materielle Träger der Erbsubstanz, die Desoxyribonucleinsäure (DNA, deoxyribonucleic acid) (siehe Box 6.1). Die lange Suche nach dem Träger der Vererbung kulminierte ein erstes Mal 1944, als Avery, MacLeod und McCarty am Rockefeller Institut eindeutig nachweisen konnten, dass die bakterielle Erbinformation in hochgereinigter DNA, nicht aber in Proteinfraktionen, enthalten ist. Ein zweiter Durchbruch basiert auf einem 1953 im Wissenschaftsjournal Nature publizierten Artikel von zwei jungen Forschern, James Dewey Watson (geb. 1928) (Abb. 6.1) und Francis Compton Crick ) (Abb. 6.2). Darin war eine einfache, aber geniale Grafik einer Doppelwendel zu sehen, die DNA-Doppelhelix. DNA-Moleküle sind vereinfacht einem verdrillten Reißverschluss vergleichbar. Der Reißverschluss besitzt allerdings vier unterschiedliche Sorten von "Zähnen": Die vier Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T). Diese Basen sind Bestandteil der Nucleotide, der eigentlichen Bausteine der DNA. Die Nucleotide ihrerseits bestehen aus einem Zucker, einer Base und einem Phosphatrest (Abb. 6.3). Fehlt dem Nucleotid der Phosphatrest, so wird diese Verbindung aus Zucker und Base als Nucleosid bezeichnet. Diese Geometrie der Doppelhelix ist nicht nur platzsparend, sondern erlaubt auch den Zugang zur Erbinformation von allen Richtungen. Desoxyribose ist der Zucker der Nucleotide. Im Unterschied zur Ribose -dem Zucker der Ribonucleinsäure (RNA) -fehlt der Desoxyribose das Sauerstoffatom am 2'-Kohlenstoff. Das Rückgrat besteht aus sich abwechselnden Desoxyribose-und Phosphateinheiten. Die Zucker sind also über Phosphodiesterbrücken miteinander verbunden. Wie Reißverschlusszähne an einer Stoffleiste sind die vier Basen an dem Rückgrat befestigt, das lediglich tragende Funktionen hat. Für die genetische Information ist allein die Reihenfolge der vier Basen von Bedeutung, die Basensequenz. Die beiden Zahnleisten eines geschlossenen Reißverschlusses werden mechanisch zusammengehalten. Im Fall der beiden DNA-Stränge sind es dagegen molekulare Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken (H-Brücken), die zwischen gegenüberliegenden Basen der beiden Einzelstränge wirken. Erwin Chargaff (Abb. 6.4) hatte 1950 mithilfe chromatografischer Methoden festgestellt, dass das Verhältnis von Adenin zu Thymin und von Guanin zu Cytosin bei allen Lebewesen stets etwa 1 beträgt (Chargaff'sche Regel). Mit diesem Wissen und den Daten der Röntgenstrukturanalysen von Rosalind Franklin wurde aus Watson und Cricks DNA-Modell plötzlich klar, warum das so sein muss: A-Basen und T-Basen sowie C-Basen und G-Basen passen räumlich exakt zueinander: Drei Wasserstoffbrücken halten G und C zusammen, zwei Wasserstoffbrücken A und T. Diese sogenannte Basenpaarungsregel (oder Watson-Crick-Regel) ist Voraussetzung für die exakte Weitergabe genetischer Information. Da stets eine Purinbase mit einer Pyrimidinbase kombiniert wird, ist der Abstand zwischen den Strängen überall gleich. Es entsteht eine regelmäßige Struktur. Die ganze Helix hat einen Durchmesser von 2 Nanometern (nm) und windet sich mit jedem Zuckermolekül um 0,34 nm weiter. Die Ebenen der Zuckermoleküle stehen in einem Winkel von 36° zueinander; folglich wird eine vollständige Drehung nach zehn Basen (360°) und 3,4 nm erreicht. DNA-Moleküle können sehr groß werden. Beispielsweise enthält das größte menschliche Chrom osom 247 Millionen Basenpaare in einem durchgehenden DNA-Faden von 8,4 Zentime tern (!) Länge. Beim Umeinanderwinden der beiden Einzelstränge verbleiben seitliche Lücken, sodass hier die Basen direkt an der Oberfläche liegen. Von diesen Furchen (grooves) gibt es zwei, die sich um die Doppelhelix herumwinden. Die "große Furche" ist 2,2 nm breit, die "kleine Furche" nur 1,2 nm. Entsprechend sind die Basen in der großen Furche besser zugänglich. Die Bindung von Proteinen an die DNA erfolgt daher meist an der großen Furche. Auch manche DNA-Farbstoffe (z. B. Ethi-Abb. 6.3 Nucleotide sind Bausteine der Nucleinsäuren (DNA und RNA), der Informationsträger der Zellen. Sie bestehen aus einem Monosaccharid (Desoxyribose oder Ribose), Base (Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin; bei RNA Uracil statt Thymin) und Phosphatrest. A und T (hier gezeigt) bilden zwei H-Brücken aus, G und C drei. Adenin Thymin Abb. 6.1 James D. Watson (geb. 1928) diumbromid, siehe weiter unten) lagern sich an einer Furche an. Bei der Replikation öffnet sich durch kontrollierte Mechanismen partiell die doppelsträngige DNA und bildet eine "Replikationsgabel". An den Nucleotiden des frei gewordenen Einzelstrangs lagern sich komplementäre Nucleotide an, also ein frei werdendes C-Nucleotid einem G-Nucleotid usw. Während die eben angelagerten Nucleotide auf der "Vorderseite" durch Wasserstoffbrücken zwischen den gepaarten Basen richtig ausgerichtet werden, verbindet die DNA-Polymerase auf der "Rückseite" die einzelnen "Rückgratelemente" aus Desoxyribose und Phosphat zu einem festen Gerüst. Die DNA-Polymerase katalysiert dabei unter Abspaltung von Pyrophosphat die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen dem 3'-OH-Ende einer bestehenden Sequenz und dem 5'-Triphosphat-Ende eines neu angelagerten Nucleotids. Ein Polynucleotid entsteht über Phosphodiesterbindungen, welche jeweils die Hydroxylgruppe am C3'-Atom eines ersten Nucleotids mit dem C5'-Atom eines zweiten Nucleotids verbinden. Die Direktionalität der Kette wird per definitionem immer von 5' (links) nach 3' (rechts) angegeben. Das 5'-Ende bzw. 3'-Ende geben hierbei die terminalen Nucleotide mit den C5'-bzw. C3'-Atomen an, die nicht über Phosphodiesterbrücken verknüpft sind. Ebenso erfolgt die DNA-Synthese in der Zelle in 5'-3'-Richtung, da Nucleotide typischerweise an das "freie" 3'-Ende eines bestehenden Nucleinsäurestranges angefügt werden. Das bedeutet, dass jeder einzelne dieser Marker dazu genutzt werden kann, Ihre spezielle Haplogruppe zu ermitteln, da jedes Individuum, das einen dieser Marker trägt, zwangsläufig auch die anderen Marker aufweist, die Marker sind also miteinander gekoppelt. Wenn Genetiker solche Marker identifizieren, versuchen sie auch herauszufinden, wann und in welcher geografischen Region der Welt diese zuerst aufgetreten sind. Jeder Marker bedeutet im Grunde die Entstehung einer neuen Abstammungslinie im Stammbaum der Menschheit. Indem man diese Abstammungslinien zurückverfolgt, kann man sich ein Bild darüber machen, wie sich kleine Volksstämme des modernen Menschen in Afrika vor Zehntausenden von Jahren auseinanderentwickelt und in die ganze Welt ausgebreitet haben. Eine Haplogruppe wird durch eine Reihe von Markern definiert; ihr gehören alle Männer an, die die gleichen zufälligen Mutationen tragen. Über die Marker lassen sich die Wanderungsbewegungen der Vorfahren zurückverfolgen. Eines der Ziele des fünf Jahre dauernden Genographic Project ist die Erstellung einer ausreichend großen Datenbank anthropologischer genetischer Daten, um einige dieser Fragen zu beantworten. Skelettfunde und archäologische Beweise legen nahe, dass sich der anatomisch moderne Mensch vor ca. 200 000 Jahren in Afrika entwickelte und von dort aus vor ca. 60 000 Jahren auszog, um den Rest der Welt zu besiedeln. Der Mann, auf den der erste genetische Marker Ihrer Abstammungslinie zurückzuführen ist, lebte wahrscheinlich vor ungefähr 31 000 bis 79 000 Jahren im Nordosten Afrikas in der Gegend des Ostafrikanischen Grabenbruchs, eventuell im heutigen Äthiopien, Kenia oder Tansania. Wissenschaftler halten einen Zeitraum von vor rund 50 000 Jahren für am wahrscheinlichsten. Seine Nachfahren bildeten die einzige Ab stammungslinie, die außerhalb Afrikas überlebt hat, und machten ihn damit zum Stammvater aller heute lebenden Nicht-Afrikaner. Aber warum wagte sich der Mensch erstmals aus den ihm bekannten afrikanischen Jagdgründen in unerforschtes Land? Wahrscheinlich gab eine Klimaveränderung den Anstoß für die Auswanderung aus Afrika. Die afrikanische Eiszeit war eher durch Trockenheit als durch Kälte charakterisiert. Vor etwa 50 000 Jahren begann die Eisdecke von Nordeuropa zu schmelzen, was in Afrika zu einer Periode mit wärmeren Temperaturen und einem feuchteren Klima führte. Dadurch wurden Teile der lebensfeindlichen Sahara für kurze Zeit bewohnbar. Als sich die sonst ausgetrocknete Wüste zur Savanne umwandelte, erweiterten die von Ihren Ahnen gejagten Tiere ihr Verbreitungsgebiet und begannen durch den neu entstandenen grünen Korridor aus Grasland zu wandern. Ihre nomadischen Ahnen folgten dem guten Wetter und den Tieren, die sie jagten. Welche Route sie genau einschlugen, muss jedoch noch ermittelt werden. Gleichzeitig kam es zusätzlich zu den günstigen Klimaveränderungen zu einem großen Evolutionssprung bei den intellektuellen Fähigkeiten des modernen Menschen. Die heute südlich der Sahara lebenden Populationen sind durch eine von drei unterschiedlichen Y-Chromosom-Abstammungslinien im Stammbaum des Menschen charakterisiert. Ihre väterliche Abstammungslinie Karte der weltweiten Wanderungen und die Wanderung meiner Vorfahren (kleines Bild). E3b ist eine dieser drei uralten Linien und wird von den Genetikern als YAP bezeichnet. YAP entstand im nordöstlichen Afrika und ist die häufigste der drei alten genetischen Linien in Afrika südlich der Sahara. Sie ist durch eine als Alu-Insertion bekannte seltene Mutation gekennzeichnet. Dabei wird während der Zellteilung ein 300 Nucleotide großes Fragment der DNA in unterschiedliche Bereiche des menschlichen Genoms eingebaut. Bei Ihrem fernen Vorfahr, einem Mann der vor ca. 50 000 Jahren gelebt hat, wurde dieses Fragment in sein Y-Chromosom eingebaut, und er gab es an seine Nachkommen weiter. Im Laufe der Zeit spaltete sich diese Abstammungslinie in zwei getrennte Gruppen auf. Die eine findet sich vorwiegend in Afrika und im Mittelmeergebiet. Sie ist charakterisiert durch den Marker M96 und wird Haplogruppe E genannt. Die andere Gruppe, Haplogruppe D, kommt in Asien vor und ist gekennzeichnet durch die M174-Mutation. Ihre eigene genetische Abstammung ist innerhalb der Gruppe zu finden, die in der Nähe des Herkunftsortes blieb. Die Träger des Merkmals spielten wahrscheinlich eine maß-gebliche Rolle für die damalige Kultur und die Wanderungen innerhalb Afrikas. Der nächste wichtige Mann Ihrer Abstammungslinie wurde vor etwa 30 000 bis 40 000 Jahren im nordöstlichen Afrika geboren. Bei ihm entstand der Marker M96. Dessen Ursprung ist noch nicht geklärt; vielleicht können weitere Daten den genauen Ursprung dieser Abstammungslinie erhellen. Sie stammen von einer uralten afrikanischen Abstammungslinie ab, die sich entschloss, nach Norden in den Mittleren Osten zu wandern. Ihre Angehörigen haben sich vielleicht dem Clan des Mittleren Ostens (mit dem Marker M89) angeschlossen, als sie den Herden der großen Säugetiere nach Norden durch die Grasländer und Savannen des Sahara-Korridors folgten. Eine Gruppe Ihrer Ahnen könnte jedoch auch zu einem späteren Zeitpunkt allein diese Wanderung vorgenommen haben und der Route des zuvor gewanderten Clans aus dem Mittleren Osten gefolgt sein. Vor etwa 40 000 Jahren begann sich das Klima erneut zu verändern und wurde kälter und arider. Eine Dürre suchte Afrika heim, und das Grasland wurde wieder zu Wüste. Für die nächsten 20 000 Jahre war der Sahara-Korridor gewissermaßen geschlossen. Durch die Unüberwindlichkeit der Wüste blieben Ihren Vorfahren nur zwei Möglichkeiten: entweder im Mittleren Osten zu bleiben oder weiterzuwandern. Der Rückzug auf den Heimatkontinent war nicht möglich. Der letzte gemeinsame Vorfahr in Ihrer Haplogruppe, der Mann bei dem der Marker M35 entstanden ist, wurde vor etwa 20 000 Jahren im Mittleren Osten geboren. Seine Nachkommen waren mit die ersten Bauern und trugen dazu bei, den Ackerbau vom Mittleren Osten bis ins Mittelmeergebiet zu verbreiten. Am Ende der letzten Eiszeit, vor ca. 10 000 Jahren, änderte sich das Klima erneut und wurde für den Ackerbau günstiger. Dies trug wahrscheinlich dazu bei, die Neolithische Revolution anzubahnen, das ist der Zeitpunkt, an dem die menschliche Lebensweise von den nomadischen Jägern und Sammlern zu den sesshaften Bauern überging. Die frühen Erfolge des Ackerbaus im fruchtbaren Halbmond des Mittleren Ostens führten vor rund 8000 Jahren zu einem starken Bevölkerungswachstum und förderten Völkerwanderungen in weite Teile des Mittelmeerraumes. Die Einflussnahme auf das Nahrungsmittelangebot stellt einen wichtigen Wendepunkt für die Menschheit dar. Statt in kleinen Gruppen von 30 bis 50 Personen zu leben, die äußerst mobil und zwanglos organisiert waren, kam es durch den Ackerbau zu den ersten Fallen der Zivilisation. Ein einzelnes Gebiet zu besetzen erforderte eine komplexere soziale Organisation und den Wandel von den verwandtschaftlichen Bindungen innerhalb einer kleinen Sippe zu den ausgefeilteren Beziehungen in einer größeren Gemeinschaft. Es förderte den Handel, das Schreiben, die Erstellung eines Kalenders und bahnte den Weg für die modernen sesshaften Gemeinden und Städte. Diese frühen Bauern, Ihre Vorfahren, brachten die Neolithische Revolution ins Mittelmeergebiet. Ihre DNA-Ergebnisse kennzeichnen Sie als Mitglied eines bestimmten Zweiges des menschlichen Stammbaumes, der sogenannten Haplogruppe B. Die oben abgebildete Vergleichende Sequenzanalyse mtDNA_CRS ATTCTAATTTAAACTATTCTCTGTTCTTTCATGGGGAAGCAGATTTGGGTACCACCCAAG 60 mtDNA_Claire_Ma ATTCTAATTTAAACTATTCTCTGTTCTTTCATGGGGAAGCAGATTTGGGTACCACCCAAG 60 ************************************************************ mtDNA_CRS TATTGACTCACCCATCAACAACCGCTATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAA 120 mtDNA_Claire_Ma TATTGACTCACCCATCAACAACCGCTATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAA 120 ************************************************************ mtDNA_CRS TATTGTACGGTACCATAAATACTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCA 180 mtDNA_Claire_Ma TATTGTACGGTACCATAAACACTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCA 180 ******************* **************************************** mtDNA_CRS AAACCCCCTCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCAATCAACCCTCAACTATCACACATCA 240 mtDNA_Claire_Ma AACCCCCCCCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCAATCAACCCTCAACTATCACACATCA 240 ** ***** *************************************************** mtDNA_CRS ACTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACCCACTAGGATACCAACAAACCTACCCACCCTTAA 300 mtDNA_Claire_Ma ACCGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACCCACTAGGATACCAACAAACCTACCCACCCTTAA 300 ** ********************************************************** mtDNA_CRS CAGTACATAGTACATAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTC 360 mtDNA_Claire_Ma CAGTACATAGCACATAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCTTTCTC 360 ********** ******************************************* ***** mtDNA_CRS GTCCCCATGGATGACCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGACCACCATCCTCCGTGAAATCA 420 mtDNA_Claire_Ma GTCCCCATGGATGACCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGACCACCATCCTCCGTGAAATCA 420 ************************************************************ mtDNA_CRS ATATCCCGCACAAGAGTGCTACTCTCCTCGCTCCGGGCCCATAACACTTGGGGGTAGCTA 480 mtDNA_Claire_Ma ATATCCCGCACAAGAGTGCTACTCTCCTCGCTCCGGGCCCATAACACTTGGGGGTAGCTA 480 ************************************************************ mtDNA_CRS AAGTGAACTGTATCCGACATCTGGTTCCTACTTCAGGGTCATAAAGCCTAAATAGCCCAC 540 mtDNA_Claire_Ma AAGTGAACTGTATCCGACATCTGGTTCCTACTTCAGGGCCATAAAGCCTAAATAGCCCAC 540 ************************************** ********************* mtDNA_CRS ACGTTCCCCTTAAATAAGACATCACGATG 569 mtDNA_Claire_Ma ACGTTCCCCTTAAATAAGACATCACGATG 569 ***************************** Schematische Darstellung der mitochondrialen DNA mit Angabe der Lokalisierung einzelner DNA-Abschnitte Dies funktioniert folgendermaßen. Hin und wieder kommt es in der Sequenz der mitochondrialen DNA zu einer Mutation, einer zufälligen, natürlich auftretenden (und gewöhnlich harmlosen) Veränderung. Stellen Sie sich das wie einen Rechtschreibfehler vor: Einer der Buchstaben in der Sequenz kann sich von einem C in ein T umwandeln oder von einem A zu einem G. Nachdem eine dieser Mutationen bei einer bestimmten Frau stattgefunden hat, gibt sie diese an ihre Töchter und die wiederum an deren Töchter weiter und so fort. (Mütter geben ihre mitochondriale DNA zwar auch an ihre Söhne weiter, diese vererben sie aber nicht an ihre Nachkommen.) Genetiker nutzen diese Marker von Menschen aus aller Welt, um einen umfassenden mitochondrialen Stammbaum zu erstellen. Wie Sie sich vorstellen können, ist der Stammbaum sehr komplex, aber mittlerweile können die Wissenschaftler sowohl das Alter als auch die geografische Verbreitung jeder Abstammungslinie bestimmen und so die prähistorischen Wanderungen Ihrer Ahnen rekonstruieren. Indem wir uns die Mutationen in Ihrem Genom anschauen, können wir Ihre Abstammungslinie von Vorfahr zu Vorfahr nachvollziehen und so deren Wanderung von Afrika aus verfolgen. Unsere Geschichte beginnt mit Ihrer frühesten Ahnin. Wer war sie, wo hat sie gelebt und wie lautet ihre Geschichte? Unsere Geschichte beginnt vor 150 000 bis 170 000 Jahren in Afrika mit einer Frau, der die Anthropologen den Spitznamen "Mitochondriale Eva" gaben. Sie erhielt diesen mythischen Beinamen 1987, als Populationsgenetiker entdeckten, dass alle heute lebenden Menschen ihre mütterliche Abstammungslinie auf sie zurückführen können. Die Mitochondriale Eva war jedoch nicht der erste weibliche Mensch. Homo sapiens entwickelte sich vor ca. 200 000 Jahren in Afrika. Die ersten Hominiden, gekennzeichnet durch ihren charakteristischen aufrechten Gang und die damit verbundenen Veränderungen des Körpers, tauchten schon fast zwei Millionen Jahre früher auf. Aber obwohl es schon seit nahezu 30 000 Jahren Menschen außerhalb Afrikas gibt, ist Eva außergewöhnlich: Ihre Abstammungslinie ist die einzige, die aus dieser fernen Zeit bis heute überlebt hat. Eine mütterliche Linie kann aus vielen unterschiedlichen Gründen aussterben. Eine Frau hat vielleicht keine Kinder oder gebiert ausschließlich Söhne (die ihre mtDNA nicht an die nachfolgende Generation weitergeben). Menschen der L2-Gruppe findet man in Afrika südlich der Sahara und wie ihre L1-Vorfahren ebenfalls in Zentralafrika bis in den tiefsten Süden nach Südafrika. Während L1/L0-Individuen vorwiegend im östlichen und südlichen Afrika blieben, schlugen Ihre Vorfahren eine andere Richtung ein, die Sie auf der Karte oben verfolgen können. Westafrika, wo sie die Mehrheit der weiblichen Abstammungslinien bilden. Und weil L2-Individuen in großer Zahl auftreten und in Westafrika weit verbreitet sind, repräsentieren L2-Haplotypen eine der vorherrschenden Abstammungslinien der Afro-Amerikaner. Unglücklicherweise lässt sich nur schwer genau feststellen, wo die L2-Linie entstanden sein könnte. Für einen Afro-Amerikaner aus der Haplogruppe L2 -wahrscheinlich ein Nachkomme von Westafrikanern, die im Zuge des Sklavenhandels nach Amerika gelangten -kann man nicht mit Sicherheit sagen, wo genau in Afrika die Linie entstanden ist. Ihr nächster wegweisender Vorfahr ist die Frau, mit deren Geburt vor ungefähr 80 000 Jahren die Haplogruppe L3 entstand. Es ist wiederum die gleiche Geschichte: Bei einem Individuum der Gruppe L2 kam es zu einer Mutation in der mitochondrialen DNA, und diese wurde an die Nachkommen weitervererbt. Die Kinder überlebten, und deren Nachkommen lösten sich letztendlich vom L2-Clan und spalteten sich schließlich zur neuen Gruppe namens L3 ab. In der Abbildung oben können Sie erkennen, dass dies als neuer Schritt in Ihrer Abstammungslinie zum Ausdruck kommt. L3-Individuen findet man zwar im gesamten Afrika, einschließlich des südlich der Sahara gelegenen Gebiets, ihre wirkliche Bedeutung liegt jedoch in ihren Wanderungsbewegungen nach Norden. Diese Wanderung können Sie auf der Karte oben nachvollziehen; sie zeigt die erste Ausbreitung von L1/L0, dann L2, gefolgt von der Wanderung von L3 nach Norden. Ihre L3-Vorfahren waren die ersten Menschen, die Afrika verließen und repräsentieren somit die untersten Äste des Stammbaumes außerhalb dieses Kontinents. Heutzutage findet man Menschen der L3-Gruppe sehr häufig in den Populationen Nordafrikas. Von dort aus wanderten Mitglieder dieser Gruppe in wenige unterschiedliche Richtungen. Manche Linien innerhalb der L3 -Gruppe zeugen von einem ausgeprägten Expansionsverhalten im mittleren Holozän, das in Richtung Süden stattfand, und sind in vielen Bantu-Gruppen in ganz Afrika vorherrschend. Eine Gruppe wandte sich nach Westen und ist in erster Linie auf das atlantische Westafrika beschränkt, einschließlich der Kapverdischen Inseln. Andere L3 -Individuen, Ihre Vorfahren, wanderten noch weiter nach Norden und verließen schließlich alle den afrikanischen Kontinent. Diese Menschen stellen mittlerweile etwa 10 % der Population im Mittleren Osten dar. Aus ihnen wiederum entstanden zwei wichtige Haplogruppen, die schließlich den Rest der Welt besiedelten. Der nächste Ihrer wegweisenden Vorfahren ist die Frau, deren Nachkommen die Haplogruppe N bildeten. Die Haplogruppe N bildet eine von zwei Gruppen, die aus den Nachfahren von L3 hervorgingen. Die Haplogruppe N war das Ergebnis der ersten großen Wanderungsbewegung des modernen Menschen außerhalb Afrikas. Diese Menschen verließen den Kontinent wahrscheinlich über das Horn von Afrika in der Nähe von Äthiopien, und ihre Nachkommen folgten der Küstenlinie ostwärts, um schließlich bis hin nach Australien und Polynesien zu kommen. Eine Gruppe dieser frühen N-Individuen setzte sich in die zentralasiatischen Steppen ab und machte sich, ihrem Jagdwild über große Entfernungen folgend, auf ihren eigenen Weg. A: Struktur der "normalen" DNA-Bausteine (links) und der Analoga (rechts). B: In jedem neu syntheti sierten DNA-Strang wird mit hoher Wahrscheinlichkeit ein DNA-Analogon eingebaut (hier C*). So entstehen verschie den lange Frag men te, die immer ein Analogon am Ende haben. C: DNA wird für jedes der vier Analoga parallel, aber getrennt synthetisiert und dann nach der Größe elektrophoretisch getrennt. Man liest die komplementäre Sequenz von unten nach oben und muss sie noch in die gesuchte übersetzen. • um regulatorische Elemente (wie Promotorgene) zu identifizieren • um genetische Mutationen (z. B. Polymorphismen) zu identifizieren Die am weitesten genutzte Methode wurde 1977 von Frederick Sanger (Abb. 6.34) entwickelt und wird als Kettenabbruchmethode (Abb. 6.35) bezeichnet. Dabei wird ein radioaktiv markierter DNA-Primer mit denaturierter template -DNA (DNA-Matrize) hybridisiert, und zwar in einem Röhrchen, das die vier Desoxyribonucleotide (dNTPs) und DNA-Polymerase enthält. Die Polymerase kopiert vom 3'-Ende der Primer ausgehend die Stränge. Ein modifiziertes Nucleotid (Didesoxyribonucleotid, ddNTP) wird untergemischt. ddNTP hat am 3'-Kohlenstoff des Zuckers nur ein Wasserstoffatom (-H) statt einer Hydroxylgruppe (-OH) gebunden. Wenn ein ddNTP in eine DNA eingebaut wird, führt das zum Abbruch (termination) der Kettenverlängerung Primer und allen vier dNTPs, aber jedes mit einer kleinen Menge nur eines der vier ddNTPs. Die Polymerase baut also zufällig ddNTPs ein, und es entsteht eine Reihe verschieden langer Fragmente Ein Polyacrylamid-Gel separiert in einer Elektrophorese die Fragmente nach ihrer Größe. Sie werden durch radioaktive Markierung und einen durch die Strahlung geschwärzten Röntgenfilm (Autoradiogramm) sichtbar gemacht Die Sanger-Kettenabbruchmethode kann nur für Sequenzen von 200 bis 400 Nucleotiden in einer Einzelreaktion angewendet werden. Man muss also z. B. für 1000 Basenpaare verschiedene Läufe durchführen und dann überlappende Sequenzen zusammenpuzzeln Oxford eine dramatische Verbesserung der DNA-Gelelektrophorese. Das nach ihm benannte Southern Blotting (Abb. 6.36) beginnt mit der Spaltung der DNA durch Restriktionsenzyme und der Auftrennung der Fragmente in einer Agarose-Gelelektrophorese (Abb. 6.23, siehe auch Kapitel 2 und 4) es bildet sich Einzelstrang-DNA für die spätere Hybridisierung. Dann legt man das Gel nach der Elektrophorese auf einen Nitrocellulosefilter (oder eine Nylonmembran), beschwert ihn und erzeugt einen Pufferfluss (durch Papierhandtücher) durch das Gel hin zum Filter oder zur Membran. Die Einzelstrang-DNA-Fragmente werden durch die Kapillarwirkung aus dem Gel auf den Filter transferiert, an den sie binden das Projekt sicher, dass ein großes Aufgebot an Forschern mit sehr unterschiedlichen Lebenserfahrungen, verschiedenen Ausbildungen und Fachkenntnissen aktiv dessen potenziell weitreichenden gesellschaftlichen Einfluss anerkannten. Sowohl das Projekt selbst als auch die Gesellschaft profitierten von diesem breit angelegten Forschungsfeld und Denken, das selbst nach Abschluss des Human Genome Project ein wertvoller Teil der Genomik geblieben ist.Eine weitere Lektion des Human Genome Project ist, dass die vollständige Sequenzierung nicht das Ende darstellt, sondern erst den Beginn. Schon gleich nach Abschluss des Human Genome Project 2003 wurden viele Stimmen laut, die vom Eintreten in die "Post-Genom-Ära" sprachen. Zwar halten wir jetzt die Sequenz des menschlichen Genoms in Händen, es ist jedoch richtiger zu sagen, dass wir gerade erst in die "Genom-Ära" eingetreten sind. Das ist ein wesentlicher Unterschied.Durch unsere Kenntnis der Sequenz des menschlichen Genoms und die vielen anderen wissenschaftlichen und technischen Fortschritte, die das Human Genome Project hervorgebracht hat, stehen wir gerade am Beginn der Ära, in der wir die Genomik anwenden können: um die Biologie und die Gesundheit und Krankheiten des Menschen besser zu verstehen und, was vielleicht noch wichtiger ist, die Gesundheit der Menschen weltweit zu verbessern.