key: cord-0033892-3rc82s9h authors: Kochanek, S. title: Gentransfer mit adenoviralen Vektoren date: 2001 journal: Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz DOI: 10.1007/s00103-001-0292-0 sha: bd5b4c977d8dc5dfcf8926b4f1e885d8309dab31 doc_id: 33892 cord_uid: 3rc82s9h Adenoviral vectors are promising vectors for somatic gene therapy in a number of inherited and acquired disorders. In this contribution, the current scientific knowledge as it relates to production and function of adenoviral vectors is summarized. The different types of adenoviral vectors are described and their respective advantages and disadvantages are delineated. Current problems with adenoviral vectors, and implications as they derive from the fatality observed in the Philadelphia gene therapy trial are discussed. Adenovirale Vektoren sind vielversprechende Vektoren für gentherapeutische Anwendungen bei zahlreichen angeborenen und erworbenen Krankheiten.In diesem Beitrag wird zunächst der für das Verständnis der Produktion und Funktion adenoviraler Vektoren notwendige Wissensstand zusammengefasst.Die Unterschiede,Vor-und Nachteile der einzelnen adenoviralen Vektortypen werden dargestellt.Derzeit bestehende Probleme und Unsicherheiten sowie Implikationen, die sich für Forschung und klinische Studien aus dem Todesfall im Zusammenhang mit der klinischen Gentherapiestudie in Philadelphia ergeben, werden diskutiert. Somatische Gentherapie · Gentransfer · Adenovirus · Adenovirale Vektoren Mit der Sequenzierung des menschlichen Genoms, der Funktionsanalyse von Genen, Genprodukten und deren Interaktionen sowie der Aufklärung der Pathogenese von Erkrankungen auf molekularer Ebene rückt die Vision einer kausalen Therapie von zahlreichen Krankheiten durch Genersatz oder Genreparatur näher. Im Prinzip könnte eine große Zahl angeborener oder erworbener Krankheiten durch die Expression eines oder mehrerer Eiweiße oder RNAs in den betroffenen Zielzellen kausal therapiert werden.Die Behandlung zahlreicher monogenetischer Krankheiten durch Ersatz des defekten Gens ist bereits in greifbarer Nähe,da das Einbringen einer normal funktionierenden Kopie des defekten Gens eine Zielzelle in ihren normalen Phänotyp überführen kann. Die somatische Gentherapie hat das Potenzial,zu einer der wesentlichen Neuentwicklungen innerhalb der Medizin zu werden. Bevor dies allerdings realisiert werden kann, wird eine große Anzahl technischer Probleme zu bewältigen sein. Um einen spezifischen Zelltyp oder ein Gewebe zu verändern, muss das therapeutische Gen effizient in die Zielzelle eingeführt werden,und das entsprechende Protein muss, eventuell in regulierter Menge, für eine ausreichend lange Zeitdauer produziert werden.Das Einbringen eines therapeutischen Gens (Gentransfer) erfolgt mit Hilfe von Vektoren, die derzeit wegen der größeren Effizienz des Gentransfers meist viralen Ursprungs sind. Die einzelnen Vektoren unterscheiden sich unter anderem in Sicherheitsaspekten und in der zellspezifischen Effizienz des Gentransfers.Für den Einsatz in der Klinik haben darüber hinaus produktionstechnische Fragen eine wesentliche Bedeutung. Viren sind intrazelluläre Parasiten, die im Verlauf der Evolution sehr effiziente und spezifische Techniken entwickelt haben, ihr DNA-oder RNA-Genom in Zielzellen einzuschleusen. Durch das Ersetzen bestimmter viraler Gene durch therapeutische Gene entstehen defekte Viruspartikel, die einerseits Zielzellen infizieren und effektiv therapeutische Gene in diese Zellen einschleusen können, andererseits aber nicht mehr in der Lage sind, einen produktiven Infektionszyklus in der Zielzelle zu durchlaufen. Adenoviren sind nicht umhüllte Viren, die ein einzelnes doppelsträngiges DNA-Genom tragen. Adenoviruspartikel haben eine ikosahedrische Form. Das Ka-psid besteht aus sieben verschiedenen Proteinen, unter ihnen Hexon, Penton-Basis und Fiber. Insgesamt fünf verschiedene Proteine sind mit der viralen DNA assoziiert. Die Dauer eines produktiven Infektionszyklus beträgt etwa zwei bis drei Tage. Unter optimalen Bedingungen werden etwa 1000 bis 10.000 infektiöse Partikel in jeder infizierten Zelle produziert. Die Infektion einer Zielzelle beginnt mit der Anheftung des Viruspartikels an einen spezifischen Rezeptor (Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR)) und erfordert zusätzlich eine Interaktion mit Integrinen auf der Zelloberfläche. Das Viruspartikel wird effizient durch Rezeptorvermittelte Endozytose internalisiert, verlässt über einen nur teilweise geklärten Mechanismus das Endosom, wird aktiv unter teilweiser Zerlegung des Kapsids durch das Zytoplasma zum Zellkern transportiert und schließlich, noch verbunden mit viralen DNA-bindenden Proteinen, in den Zellkern eingeschleust. Nach Eintritt der viralen DNA in den Zellkern werden nach kurzer Zeit die ersten Virusgene exprimiert, die die Bezeichnung E1A und E1B (E=Early) tragen, da sie früh nach Infektion der Zelle aktiviert werden. Die E1Aund E1B-Gene initiieren ein komplexes Transkriptionsprogramm, das darauf abzielt, zunächst die virale DNA zu replizieren und später die viralen Struk-turproteine zu bilden. Nach Bildung infektiöser Viruspartikel geht die infizierte Zelle zu Grunde, und Viruspartikel werden in die Umgebung freigesetzt. Die E1A-und E1B-Genprodukte sind für die Aktivierung zellulärer und viraler Gene verantwortlich. Die E1A-und E1B-Gene bestimmter Serotypen (z. B. von Ad12) können, nach Integration in das zelluläre Genom, unter bestimmten Bedingungen zur Transformation der Zelle führen, deshalb auch ihre funktionelle Einordnung in die Kategorie der Onkogene. Die Expression der E1-Funktionen ist für die nachfolgende Aktivierung der E2A-und E2B-Gene erforderlich. Die Produkte der E2-Gene spielen eine wesentliche Rolle in der Replikation des adenoviralen Genoms und kodieren für die virale DNA-Polymerase (Ad-Pol), das terminale Protein (TP) und das DNA-bindende Protein (DBP). Die E3und E4-Gene haben eine Reihe verschiedener Funktionen. Unter anderem aktivieren sie andere Promotoren, unterdrücken die Abwehr der Wirtszelle und tragen zur präferentiellen Translation der viralen RNA bei. In der späten Pha-se des Infektionszyklus und nach Beginn der Replikation des viralen Genoms werden die viralen Strukturproteine hergestellt, die für die Bildung des viralen Kapsids und die Organisation des viralen Genoms im Inneren des Kapsids benötigt werden. Der aktivste Promoter in dieser Phase ist der "späte Hauptpromoter" MLP (major late promoter), der für die Transkription einer langen primären RNA verantwortlich ist, die etwa zwei Drittel des viralen Genoms umfasst. Von diesem Transkript werden durch alternatives Spleißen und Polyadenylierung fünf Familien von Strukturproteinen (L1-L5) gebildet. Die Zelle wird im Laufe der Infektion fast völlig in eine Fabrik für die Bildung von Viruspartikeln umfunktioniert. Adenovirale Vektoren erweisen sich als sehr potente Gentransfervektoren, da sie in der Lage sind, ein sehr weites Spektrum an Zelltypen und Geweben zu infizieren. Obwohl sie nicht in das Wirtsge-nom integrieren, ermöglichen sie eine sehr gute Expression des therapeutischen Transgens. Darüber hinaus können adenovirale Vektoren relativ einfach in hohen Konzentrationen in entsprechenden Verpackungszelllinien hergestellt werden, eine wichtige Vorraussetzung für die Verwendung dieser Vektoren im Rahmen klinischer Studien. In Versuchsmäusen kommt es nach intravenöser Gabe der Vektoren zu bevorzugter Transduktion von Hepatozyten. Aus diesem Grund sind adenovirale Vektoren von besonderem Interesse für die Therapie von Krankheiten, die eine Expression des therapeutischen Proteins in der Leber erfordern. Wie bereits erwähnt, spielen die E1A-und E1B-Proteine eine wesentliche Rolle in der frühen Phase des viralen Vermehrungszyklus. Sie sind für die Regulation der Expression der viralen Funktionen verantwortlich und spielen auch für die Regulation zellulärer Prozesse eine wichtige Rolle. Bei adenoviralen Vektoren der so genannten ersten Generation [2] wurden die essenziellen E1-Funktionen und eventuell weitere, für die Virusvermehrung nicht essenzielle Funktionen aus der E3-Region (hauptsächlich beteiligt an der Modulation der Immunreaktion) entfernt (Abb. 1). Adenovirale Vektoren, die die E1-Funktionen nicht mehr exprimieren, sind zwar in der Lage, effizient Zielzellen zu infizieren, können sich in diesen Zellen aber nicht mehr vermehren. Dies bedeutet, dass diese Vektoren in einer Verpackungszelllinie produziert werden müssen, die die E1-Funktionen in trans zur Verfügung stellt (in der Vergangenheit meist 293-Zellen). Ein Nachteil der Verwendung von 293-Zellen für die Produktion von E1-deletierten adenoviralen Vektoren ist die während des Herstellungsprozesses häufige Entstehung von so genannten replikationskompetenten Adenoviren (RCA). Hierbei handelt es sich um ein die E1-Region enthaltendes Wildtypvirus, das durch homologe Rekombination mit den in der 293-Zelllinie chromosomal integriert vorliegenden adenoviralen E1-Sequenzen entsteht. Neuere Produktionszelllinien schließen dieses Problem durch ein verbessertes Design aus. Ein großer Nachteil dieser Vektoren ist, dass nach Gentransfer trotz Entfernung der E1-Funktionen immer noch zahlreiche virale Funktionen exprimiert werden (wenn Mit diesen neuen adenoviralen Vektoren wurde in mehreren präklinischen Studien eine sehr lang andauernde und hohe Expression erreicht. So konnte, um nur einige Anwendungen zu erwähnen, nach hepatischem Gentransfer des alpha-1-Antitrypsingens in Labormäusen konstante Expression mit supraphysiologischem alpha-1-Antitrypsin-Serumspiegel über mehrere Monate erreicht werden [6, 7] . Weiter konnte nach intramuskulärem Gentransfer der Dystrophin-cDNA eine stabile Expression mit korrekter Membranlokalisation des Proteins und ein stark verbesserter histologischer Phänotyp in einem Dystrophin-Mausmodell erreicht werden [8] . Tierexperimente habe gezeigt,dass die Toxizität dieser neuen Vektoren im Vergleich zu Vektoren der ersten Generation deutlich reduziert ist.Da diese Vektoren keine Virusfunktionen mehr enthalten, ist die Expressionsdauer des therapeutischen Gens deutlich verlängert. Ein Nachteil dieser neuen Vektoren ist die derzeit noch relativ komplizierte Produktion. Wie bereits erwähnt, besitzt keines der beschriebenen Vektorsysteme alle gewünschten Eigenschaften für einen Gentransfer in optimaler Kombination. Eine mögliche Strategie, diese gewünschten Charakteristika zu kombinieren, ist die Entwicklung so genannter chimärer Vektoren. Hierbei werden Vorzüge verschiedener Vektorsysteme miteinander kombiniert. So zeigen z. B. adenovirale Vektoren eine vielversprechende Effizienz in der Transduktion in verschiedenen Geweben in vivo. Für bestimmte Anwendungen ist es jedoch von Nachteil, dass das Vektorgenom in der transduzierten Zelle episomal vorliegt und in proliferierenden Zellen mangels Replikation verloren geht. Auf der anderen Seite sind retrovirale Vektoren sehr effizient in der Integration des Transgens in das Genom der transduzierten Zelle, sind aber von begrenztem Nutzen für einen In-vivo-Gentransfer. Adenoretrovirale chimäre Vektoren könnten daher die hohe Effizienz des Gentransfers von adenoviralen Vektoren mit den integrierenden Eigenschaften retroviraler Vektoren vereinen. Ebenso wird derzeit das Potenzial chimärer Adenovirus/Adenovirus-Assoziiertes-Virus (AAV)-Vektoren getestet. Die Eigenschaften dieser chimären Vekoren werden derzeit in vitro und in vivo in Labortieren intensiv untersucht. Die hier beschriebenen Vektorsysteme sind für den Gentransfer in verschiedene Zelltypen (z. B. Hepatozyten) gut geeignet, haben jedoch eine relativ geringe Spezifität und für manche primäre Zelltypen teilweise auch eine nur sehr geringe Transduktionseffizienz. Wünschenswert wären Vektorsysteme, die für die spezifische und effiziente Transduktion ausgewählter Zielgewebe geeignet sind. Durch Veränderung einer oder mehrerer Komponenten des Viruskapsids bzw. der Virushülle wird derzeit bei zahlreichen Vektortypen, so auch bei adenoviralen Vektoren, versucht, die Spezifität und Effizienz des Gentransfers zu verbessern. Beispielsweise kann durch Einbringen eines RGD-Epitops in das Viruskapsid die Effizienz des Gentransfers in α v β3/5 Integrin-exprimierende Endothelzellen erhöht werden. Gerade auf dem Gebiet des Vektor-Targetings sind in der nahen Zukunft wesentliche Fortschritte zu erwarten. Wie bekannt ist, kam es im Verlauf einer in Philadelphia durchgeführten klinischen Gentherapiestudie zu einem Todesfall mit weitreichenden Folgen für die Durchführung von Gentherapiestudien im Allgemeinen.Auf die viel diskutierten Versäumnisse bei der Durchführung soll hier nicht eingegangen werden. Während im Zusammenhang mit der Verwendung von adenoviralen Vektoren für den Gentransfer in der Vergangenheit in erster Linie adaptive, gegen virale Proteine gerichtete Immunvorgänge diskutiert wurden, rückt in jüngster Zeit, nicht zuletzt auch im Zusammenhang mit dem Todesfall, der Einfluss der natürlichen Immunität für frühe Ereignisse unmittelbar im Anschluss an den Gentransfer in den Vordergrund der Diskussion. Nach intravenöser Injektion adenoviraler Vektoren kommt es in erster Linie zum Gentransfer in die Leber und zur Expression in Hepatozyten. Von verschiedenen Arbeitsgruppen konnte in den vergangenen Jahren gezeigt werden, dass jedoch nur ein kleiner Teil einer injizierten Vektordosis in die primären Leberzellen, wie gewünscht, gelangt. Mehr als 90% der Dosis wird von Makrophagen, in erster Li-Leitthema: Gentherapie: Forschung, Entwicklung und Regularien nie von leberständigen Kupfferzellen, innerhalb von Minuten vermutlich durch Phagozytose aus dem Gefäßsystem entfernt [9, 10] . Die Aufnahme in Makrophagen geht nach dem derzeitigen Kenntnisstand mit einer Aktivierung dieser Zellen einher, die sich unter anderem in einer Produktion verschiedener Zytokine, z. B. von IL-6, äußert. Es ist wahrscheinlich, dass die frühe Hepatotoxizität, die nach Injektion hoher Dosen adenoviraler Vektoren der ersten Generation beobachtet wird, zumindest zum Teil durch direkte Aktivierung der ortsständigen Kupfferzellen durch das Viruskapsid bedingt ist. Nach Depletion der Kupfferzellen (im Tierexperiment durch verschiedene Verfahren möglich) ist die Toxizität nach adenoviralem Gentransfer deutlich reduziert und die Effizienz des Gentransfers in die Hepatozyten wesentlich erhöht. Auf der anderen Seite habe unsere Untersuchungen gezeigt, dass die Hepatotoxizität bei Verwendung von HC-Ad-Vektoren im Vergleich zu Vektoren der ersten Generation deutlich reduziert ist. Aus diesem Grund gehen wir derzeit davon aus, dass die nach adenoviralem Gentransfer beobachtete Toxizität mehrere Ursachen hat: einerseits die direkte Aktivierung von Makrophagen (oder zusätzlich anderer Zellen) durch das virale Kapsid (hier würde man keinen Unterschied zwischen adenoviralen Vektoren verschiedener Generationen erwarten); andererseits die Expression von viralen Funktionen im Falle von Vektoren der ersten (und vermutlich auch der zweiten) Generation nach Gentransfer in Hepatozyten, Makrophagen oder weiteren Zelltypen (z. B. Endothelzellen, die ebenfalls von adenoviralen Vektoren relativ effizient transduziert werden). -3 current topics in microbiology and imunology Evaluation of the transfer and expression in mice of an enzyme-encoding gene using a human adenovirus vector Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy High-capacity adenoviral vectors for gene transfer and somatic gene therapy A helperdependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal A high capacity adenovirus vector with all viral genes deleted results in improved in vivo expresssion and decreased toxicity High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological Levels of α 1 -Antitrypsin with negligible toxicity In vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin with an adenoviral vector that lacks all viral genes Enhancement of in vivo adenovirus-mediated gene transfer and expression by prior depletion of tissue macrophages in the target organ Sequestration of adenoviral vector by Kupffer cells leads to a nonlinear dose response of transduction in liver Ein weiterer Aspekt, der eine wesentliche Rolle für die Effizienz des Gentransfers nach Injektion in die Blutbahn spielt, ist eine vorbestehende antiadenovirale humorale Immunität. Im Erwach-senenalter weisen mehr als 75% der Bevölkerung Antikörper gegen Adenovirus Typ 5 auf. Von Tierexperimenten ist bekannt, dass die Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern serotypspezifisch den hepatozytären Gentransfer verhindert. Es ist nicht auszuschließen, dass die An-oder Abwesenheit von antiadenoviralen Antikörpern nicht nur die Effizienz des Gentransfers, sondern auch die mit der Injektion des Vektors verbundene Toxizität in der einen oder anderen Richtung beeinflussen kann. Völlig unklar ist, ob sich möglicherweise verschiedene Individuen in ihrer Reaktion auf den Gentransfervektor voneinander unterscheiden. Es ist unbestritten, dass Infektionsneigung gegenüber verschiedenen Mikroorganismen polygen determinierten Einflüssen unterliegt.Aus diesem Grund ist es auch nicht auszuschließen, dass es nach Gentransfer gelegentlich zu Reaktionen kommen kann, die nur bei einem Teil der Probanden auftreten. Allerdings spricht im Zusammenhang mit dem Todesfall meines Erachtens nicht viel für eine besondere individuelle Disposition. ISBN 3-609-51560-0)