Microsoft Word - animals-655750.docx     Animals 2020, 10, 23; doi:10.3390/ani10010023  www.mdpi.com/journal/animals  Article  Leptospira Seroprevalence in Bardigiano Horses in  Northern Italy  Elena Vera, Simone Taddei *, Sandro Cavirani, Jennifer Schiavi, Mario Angelone, Clotilde S.  Cabassi, Emiliana Schiano and Fausto Quintavalla  Department of Veterinary Science, University of Parma, via del Taglio 10, 43126 Parma, Italy;  elenavera.dvm@gmail.com (E.V.); sandro.cavirani@unipr.it (S.C.); jennifer.schiavi93@gmail.com (J.S.);  marioangelonevet@libero.it (M.A.); clotildesilvia.cabassi@unipr.it (C.S.C.); emiliana.schiano@unipr.it (E.S.);  fausto.quintavalla@unipr.it (F.Q.)  *  Correspondence: simone.taddei@unipr.it  Received: 14 November 2019; Accepted: 18 December 2019; Published: 20 December 2019  Simple  Summary:  Leptospirosis  is  one  of  the  most  widespread  zoonoses  worldwide  and  is  considered a re‐emerging disease. In horses, leptospiral infection frequently does not result in a  systemic disease and it is commonly believed that horses play a minor role in spreading the disease,  compared to other livestock and wild animals. However, horses can become carriers and it has been  suggested  that  the  horse  is  the  maintenance  host  for  serovar  Bratislava.  Epidemiological  data  regarding leptospirosis in horses in Europe are lacking and further studies are required. The aim of  this study was to evaluate Leptospira seroprevalence in Bardigiano horses living in the Province of  Parma,  Northern  Italy,  and  to  identify  risk  factors  associated  with  seropositivity.  A  high  seroprevalence against Leptospira spp. among Bardigiano horses and a high number of infected  farms were  found. Unexpectedly, seroprevalence was considerably higher compared  to similar  studies  carried  out  in  Italy.  The  location  of  the  farm  and  the  type  of  housing  did  not  affect  seroprevalence, but rodent control might reduce the risk of exposure for Bardigiano horses. Horses  living in the considered area have high‐risk exposure to different serovars of pathogenic leptospires  and could contribute to the maintenance of the bacterium in the environment.  Abstract: A cross‐sectional study was carried out in Bardigiano horses in the Province of Parma,  Northern  Italy,  to  assess  the  seroprevalence  of  Leptospira  spp.  and  to  investigate  risk  factors  associated with the infection. A representative sample of 134 horses from 43 farms was selected by  stratified  systematic  randomization.  Blood  sera  were  examined  by  MAT  for  the  presence  of  antibodies against seven Leptospira serovars. Ninety animals (67.2%; 95% Confidence Interval 63.2– 71.1) and 41 farms (95.3%; 95% CI 92.2–98.5%) were found positive to at least one of the serovars.  The  most  frequently  detected  reactions  were  against  serovar  Bratislava  (41.8%),  followed  by  Canicola  (36.6%), Tarassovi  (28.4%), Copenhageni  (17.9%), Pomona  (10.4%) and Hardjo  (2.2%).  None  of  the  sera  reacted  against  serovar  Grippothyphosa.  Forty‐eight  horses  (53.3%  of  the  seropositives) were positive for more than one serovar and 21 (15.7% of the seropositives) had serum  titres  ≥ 1000. Bratislava was  the serovar providing  the highest antibody  titres. Prevalence was  significantly higher between adult horses and in farms lacking rodent control (p = 0.006 and p =  0.025, respectively). No significant gender or housing‐related difference  in seroprevalence was  found. The anamnestic data suggest that the infection in Bardigiano horses is subclinical in most of  the cases. The high seroprevalence indicates that Bardigiano horses living in the investigated area  are at high risk of exposure and infection by Leptospira spp.  Keywords: Bardigiano; horse; leptospirosis; risk factors; seroprevalence    Animals 2020, 10, 23  2  of 11  1. Introduction  Leptospirosis is caused by spirochetes belonging to the genus Leptospira (family Leptospiraceae,  order Spirochaetales) and is one of the most widespread zoonoses worldwide [1,2]. Wild animals,  livestock and pets can act as reservoirs of the bacterium. In Italy, reporting of cases of this disease is  mandatory with this zoonoses being monitored according to the countryʹs epidemiological situation  (Directive 2003/99/EC). However, due to a non‐specific clinical picture,  leptospirosis  is often not  recognized and widely underestimated in both humans and animals. Therefore, laboratory tests are  paramount for diagnosis [3].  As recently suggested [4], epidemiological data regarding leptospirosis in horses in Europe are  lacking. In horses,  leptospirosis does not commonly cause systemic disease [5]. Infection during  pregnancy can result in placentitis, abortion, stillbirths or neonatal mortality, birth of weak foals [6].  Renal localization of serovar Pomona occasionally causes fever and acute renal failure, especially in  foals [5]. The classic icteric form of leptospirosis could be observed in young animals, whereas it is  not commonly reported in adult horses. Moreover, Leptospira spp. is considered as the most common  infectious cause of equine recurrent uveitis (ERU) [5]. Respiratory disorders may also occur [7,8].  The Bardigiano is an ancient horse breed from the Northern Apennine region of Italy. The first  information on the Bardigiano horse dates back to 1864 and the origin of the breed can be traced to  the horse of Belgian Gaul [9]. The breed takes its name from the medieval village of Bardi, located in  the Province of Parma, and consists of a homogeneous population of horses with typical and distinct  traits. The Bardigiano horse falls into the pony category. The breed is meso‐brachymorphic type and  the coat color is bay, with dark bay being the most prevalent. The traditional use of Bardigiano horse,  long since appreciated for its rusticity and docility, was that of agricultural work in mountain areas,  besides meat production. However, in recent decades, the Bardigiano horse was also confirmed to be  very  suitable  for  use  as  a  saddle  horse,  especially  for  tourism  purposes,  and  for  pet  therapy.  Bardigiano horse breeding is widespread in the Province of Parma and in hilly and mountainous  areas of the Regions Emilia‐Romagna, Liguria and Tuscany. However, this breed is spreading to other  Italian regions, as well as to other European nations, such as Germany and Hungary. In Italy, the  current population is estimated at 3500 Bardigiano horses (data from the Ministry of agricultural  food,  forestry  and  tourism  policies.  Available  online:  https://www.politicheagricole.it/flex/cm/pages/ServeBLOB.php/L/IT/IDPagina/6179 (accessed on 17  September 2019)), with the Province of Parma accounting for about 700 animals. Most of them are  kept out on pasture, being stabled during the winter only.  The aim of this study was to evaluate the seroprevalence of Leptospira in Bardigiano horses living  in the Province of Parma and to identify risk factors associated with seropositivity.  2. Materials and Methods    2.1. Horses  The study was carried out in 2016–2017 on 134 Bardigiano horses living in 43 different farms of  the Province of Parma (Figure 1).    Animals 2020, 10, 23  3  of 11    Figure 1. Location of farms. The province of Parma is highlighted by the black outline. Each farm is  indicated by a circle. The number of tested animals in each farm is indicated by Arabic numerals. The  proportion of positive and negative animals among the horses tested in each farm is shown in red  and green, respectively.  The farms were assigned to two different groups. The ‘mountain’ group included the farms  located in the municipalities of Albareto, Bardi, Bedonia, Berceto, Borgo Val di Taro, Compiano,  Corniglio, Monchio delle Corti, Palanzano, Tornolo and Varsi. The ‘valley’ group included the farms  located in the municipalities of Colorno, Fidenza, Lesignano de’ Bagni, Medesano, Montechiarugolo,  Noceto, Parma, Salsomaggiore Terme and Salsominore. The altitude of the farms in the valley area  ranged from 25 to 290 m above sea level (mean ± standard deviation: 128 ± 75) and that of the farms  in the mountain area ranged from 440 to 1050 m above sea level (666 ± 154).  None of the animals were vaccinated against leptospirosis. The sample size required to estimate  the prevalence of Leptospira in horses was determined to be at least 132 horses (population size 700,  data provided by the breeders’ association of the Province of Parma). The expected prevalence was  12%. The value of the expected prevalence was established on the basis of the higher leptospirosis  seroprevalence value reported in surveys carried out on horses in Italy and available at the time of  study planning [10,11]. The accuracy and confidence level were 5% and 95%, respectively. Animals  were selected by stratified systematic randomization. Stratification was based on the type of housing.  2.2. Sampling  Blood samples were collected by venipuncture of the jugular vein into 10 mL tubes (Vacutainer,  Becton Dickinson) without anticoagulant, kept at refrigeration  temperature and delivered  to  the  laboratory within the same day. Each serum was immediately separated by centrifugation at 1000 g  and stored at −20 °C until  it was analyzed. Blood sampling was conducted  in compliance with  national  (Decreto  Legislativo  n.  26/2014,  art.  2)  and  European  (Directive  2010/63/EU)  laws  and  policies regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes.  Moreover, the present project was approved by the Ethical Committee of the University of Parma  (Organismo  Preposto  al  Benessere  degli  Animali—prot.  n.  04/CE/2019).  For  each  animal,  an  Animals 2020, 10, 23  4  of 11  anamnestic form was completed at the time of sampling to obtain information regarding horse’s sex,  age, medical history and health status (with particular reference to the clinical signs attributable to  leptospirosis, such as abortion and still births, uveitis, fever, kidney disease and jaundice), in addition  to farming conditions. The form also contained questions concerning the presence of other domestic  or wild animals that could come in contact with the horses, either directly or through the sharing of  grazing pastures. Finally, the presence of integrated pest control management was investigated.  2.3. Serology  A  microscopic  agglutination  test  (MAT)  was  performed  using  a  panel  of  seven  Leptospira  serovars (serogroup Australis, serovar Bratislava; serogroup Canicola, serovar Canicola; serogroup  Icterohaemorrhagiae,  serovar  Copenhageni;  serogroup  Grippotyphosa,  serovar  Grippotyphosa;  serogroup Sejroe, serovar Hardjo; serogroup Pomona, serovar Pomona; serogroup Tarassovi, serovar  Tarassovi). Leptospira strains were cultured in liquid EMJH medium (Becton Dickinson) for three– four days at 30 °C (to a density of approximately 2–4 × 108 leptospires per ml) and diluted 1:2 in sterile  saline. All sera were  first screened at 1:100 dilution by adding 150 L of  the diluted Leptospira  suspensions  to  25  L  of  each  serum  previously  diluted  1:14  in  sterile  saline.  After  four  hours  incubation at 37 °C [12], 8–10 L of each suspension was transferred on a slide and examined under  a dark field microscope (Eclipse 50i, Nikon) at 100× magnification. Sera that gave a positive reaction  were further titrated in serial two‐fold dilutions, starting from 1:125 to titre end‐point. Antibody titres  were expressed as the reciprocal of the highest dilution of serum that gave 50% or more of reduction  of free leptospires in the suspension, compared to a negative control obtained by using sterile saline.  A positive reaction of a serum against all serovars would be considered non‐specific. A titre ≥ 100  was deemed positive, i.e., indicating Leptospira exposure or infection.  2.4. Statistical Analysis  Statistical analysis was performed using the chi‐squared test. p values lower than 0.05 were  regarded as statistically significant.  3. Results  Ninety horses from 41 different farms exhibited positive MAT titres to one or more serovars of  Leptospira at a serum dilution of 1:100. This means that 67.2% (95% Confidence Interval 63.2–71.1) of  the animals and 95.3% (95% CI 92.2–98.5%) of the farms were positive. Clinical signs compatible with  leptospirosis were recorded in two horses. One presenting uveitis and the other one having had an  abortion. The horse with uveitis was seronegative, while the animal who had an abortion was positive  to serovars Bratislava and Canicola. The highest number of positive animals was  found  for  the  Bratislava serovar, followed by Canicola, Tarassovi, Copenhageni, Pomona and Hardjo (Table 1). No  animals were found positive for the serovar Grippotyphosa.  Table 1. Distribution of MAT antibody titres for each Leptospira serovar.  Serovar  Number of Positive Animals for Each  Antibody Titre  Number of Positive  Animals/Overall (%)  125  250  500  1000  2000  4000  Bratislava  18  17  5  3  6  7  56/134 (41.8)  Canicola  20  17  8  4  0  0  49/134 (36.6)  Copenhageni  12  9  3  0  0  0  24/134 (17.9)  Grippotyphosa  0  0  0  0  0  0  0/134 (0)  Hardjo  1  2  0  0  0  0  3/134 (2.2)  Pomona  8  3  2  0  1  0  14/134 (10.4)  Tarassovi  22  14  2  0  0  0  38/134 (28.4)  Total  81  62  20  7  7  7    Animals 2020, 10, 23  5  of 11  Forty‐six point seven percent (42/90) of the seropositive horses reacted against a single serovar  and 53.3% (48/90) was found to be positive to multiple serovars (Table 2).    Table 2. Number of animals with single or multiple seropositivity.  Number of Serovars to Which  the Animal was Positive  Animals/Overall Number of Positives (%)  1  42/90 (46.7)  2  15/90 (16.7)  3  22/90 (24.4)  4  9/90 (0.1)  5  2/90 (2.2)  6  0/90 (0)  7  0/90 (0)  The highest frequency of multiple positivity was detected against the pair of serovars Canicola  and Tarassovi, followed by Bratislava–Canicola and Copenhageni–Tarassovi pairs, which showed  the same value (Figure 2).    Figure 2. Multiple seropositivity. The number of positive animals for each pair of serovars is reported.  Serovar pairs are indicated by the name on the abscissa and the color of the bar.  Most of the MAT titres were relatively low. The highest titer was 4000 and the modal titer was 125  (Table 1 and Figure 3). Among the seropositives, 21/134 (15.7%) showed antibody titres greater than  or equal to 1000. All the seropositives with antibody titres greater than or equal to 1000 were positive  to a single serovar. In particular, 16 towards Bratislava, four towards Canicola and one towards  Pomona. The Bratislava serovar was also the one that gave the highest antibody titres: out of 16  Bratislava positive sera with values ≥1000, seven reacted with antibody titer equal to 4000 (Table 1  and Figure 3).  Animals 2020, 10, 23  6  of 11    Figure 3. Heat map of seropositivity to the different serovars.  Animals 2020, 10, 23  7  of 11  The results for potential risk factors are shown in Table 3.  Table  3.  Distribution  of  seroprevalence  for  Leptospira  spp.  by  demographic,  geographic  and  management factors.  Potential Risk Factor  Tested  Animals  Positive  Animals  Seroprevalence  (%)  95% CI 1  Age          1–5 years  18  7  38.9  27.6–50.1  6–15 years  93  69  74.2  69.7–78.6  16–30 years  23  14  60.9  50.9–70.8  Sex          Female  97  66  68.0  63.4–72.7  Male  24  17  70.8  61.7–79.9  Gelding  13  7  53.8  40.3–67.4  Location of the farm          Mountain  102  70  68.6  64.1–73.1  Valley  32  20  62.5  54.1–70.9  Rodent control          Yes  52  29  55.8  49.0–62.5  No  82  61  74.4  69.7–79.1  Housing          Box or paddock  34  22  64.7  56.7–72.7  Free ranging  100  68  68.0  63.4–72.6  Presence of other domestic  animals 2          Yes  95  64  67.4  62.7–72.1  No  39  26  66.7  59.3–74.1  Presence of wild animals 3          Yes  85  55  64.7  59.6–69.8  No  49  35  71.4  65.1–77.8  1 Confidence interval. 2 Reported domestic animals: cats, dogs, goats, poultry and pigs. 3 Reported  wild animals: deer, foxes, roes, wolves, wild boars.  A statistically significant higher seroprevalence was detected with increasing age (p = 0.011). No  significant difference of seroprevalence was detected between 6–15 and 16–30 year‐old animals (p =  0.205). Statistical significance further increases (p = 0.006) by comparing the group of all adult animals  (6–30 years old) with the group of young animals (1–5 years old). Similarly, a significantly higher  seroprevalence (p = 0.025) was found for horses belonging to farms without rodent control programs  compared to those belonging to farms in which preventive measures against rodents were taken.  Comparing  free ranging horses with  those kept  in a box or paddock, no statistically significant  difference  was  observed  (p  =  0.724).  The  different  seroprevalence  between  horses  within  the  ‘mountain’ group and  ‘valley’ group was not statistically significant (p = 0.520). The presence of  domestic or wild animals did not significantly affected seroprevalence  (p = 0.937 and p = 0.425,  respectively).  Regarding  sex,  no  significant  difference  between  males  and  females  was  found,  counting stallions and geldings separately (p = 0.542) or grouping them together (p = 0.726).  4. Discussion  The prevalence and impact of leptospirosis in horses remain unclear, especially in European  countries  [4].  The  incidence  of  the  disease  and  the  serovars  involved  vary  according  to  the  geographical area [5,13]. Horses are not commonly considered a possible source of  leptospirosis  diffusion compared to other livestock and wild animals. However, horses may harbor leptospires in  the kidney, becoming carriers and causing the spread of the bacterium in the environment [6]. The  Animals 2020, 10, 23  8  of 11  present  study  assessed,  using  the  MAT,  the  prevalence  of  antibodies  against  seven  serovar  of  Leptospira in Bardigiano horses living in the Province of Parma. We found that 67.2% of the animals  exhibited positive MAT titres to at least one serovar and 53.3% of positive horses had antibodies  against more serovars. Seropositivities to more serovars may be due to multiple infections or to cross‐ reactivities. Since all the horses involved were not vaccinated against leptospirosis, we concluded  that  the  detection  of  antibodies  was  indicative  of  Leptospira  exposure  or  infection.  The  high  seroprevalence of Leptospira spp. found in Bardigiano horses is in agreement with other Europeans  reports. Seroprevalences of 58.5% and 79% were  found  in Switzerland and  in  the Netherlands,  respectively [14,15]. In a Brazilian study, the percentage of seropositivity was 71.4% [16] and a recent  study carried out in some States of the American Midwest reported a 77% seroprevalence in healthy  horses [17]. Surprisingly, a group of Italian researchers [10,11] reported a seroprevalence of 11.4%  and 1.5%, respectively. Ebani et al.  (2012) ascribed  the results of  their study  to  the  type of  the  environment. The horses included in their study lived in areas with a low presence of stagnant water  and under good management conditions. The hydrologic density is recognised to be a risk factor [18].  The  territory  of  the  Province  of  Parma  belongs  to  a  geographical  area  different  from  the  one  considered by Ebani et al. (2012). In fact, it is included in the Padanian hydrographic district, which  is characterized by rainfall and water runoff values higher than all other Italian hydrographic districts  (report of the National Statistical Institute—Giornata mondiale dell’acqua, 2015. Available online:  https://www.istat.it/it/files//2015/03/Statistiche‐sullacqua.pdf).  The considered territory is crossed by several rivers and numerous channels for water flow  regulation. Moreover, the climate of the Po Valley is characterized by high humidity compared to  other part of Italy. Furthermore, in the study of Cerri et al. (2003), a cut‐off of 400 was used to consider  a serum positive and this reduces the prevalence value compared to a cut‐off of 100. A 400 cut‐off is  useful to reduce possible cross‐reactions and vaccinal antibodies interference [19]. However, in this  study, antibody interference by vaccination could be excluded as none of the horses were vaccinated  against leptospirosis. Several years later, another Italian study reported a seroprevalence of 29.7%  with a 100 cut‐off value [19]. This last study was a nationwide serological survey involving 747 horse  sera collected by all 10 Italian Istituti Zooprofilattici Sperimentali (IIZZSS) between 2010 and 2011.  Another very recent study reported a seroprevalence of 2.89% with a 100 cut‐off value [20]. In this  case, only 74 horse sera collected  in North‐Central Italy  in the period 2002–2016 were tested. In  accordance with literature data [10,14,19,21,22], in this study, Bratislava was the serovar showing the  highest prevalence of MAT positive reactions. Serovar Bratislava is considered by most researchers  to be the host‐adapted serovar in the horse and horses may also act as maintenance hosts [21–24].  Twenty‐one horses exhibited antibody titres ≥ 1000 to serovars Bratislava, Canicola and Pomona.  Bratislava was the serovar with the highest MAT titres. It might be unusual for an host‐adapted  serovar, but not completely unexpected [22]. In endemic areas, titres ≥ 800–1600 in the presence of  compatible symptoms may be considered indicative of leptospirosis [25]. All horses involved in this  study did not show clinical signs attributable to leptospirosis, except for two subjects in which uveitis  and abortion were reported. In both cases, the origin of the disorder could not be established. The  horse with uveitis was seronegative to all serovars tested. However, the involvement of Leptospira  cannot  be  excluded  since  it  has  been  proved  that  serology  alone  may  not  be  able  to  diagnose  Leptospira‐associated uveitis [4,26–28]. Interestingly, there were no seropositive animals for serovar  Grippotyphosa. While this serovar occurs sporadically  in horses,  it  is considered to be the most  common serovar associated with ERU in Europe [29]. The horse that aborted was seropositive and  antibody titres were 500 against Bratislava and 125 against Canicola. Therefore, the involvement of  one of these serovars in that abortion cannot be excluded. The results are thus in agreement with  those reported by different authors: seropositive or infected horses are, in most cases, asymptomatic  [5,22].  Our data show a significatively higher seropositivity to Leptospira spp. in adult horses compared  to young horses. This result is in agreement with data reported by other authors [15,21,24] and could  be explained considering that the probability of coming into contact with Leptospira increases with  increasing age and that the seropositivity can persist for a long time. However, other authors have  Animals 2020, 10, 23  9  of 11  found no significant association between seropositivity and age [30]. Contrarily to what was reported  by other studies [15,21,30,31], in this survey, sex differences were not significantly associated with  seropositivity. The Province of Parma is characterized by mountains to the south‐west and plains to  the north‐east. Free‐ranging horses cannot pass from one area to the other, due to the anthropization  of the territory which limits the movement of these animals. Therefore, the location of the farms was  also evaluated as a potential risk factor. The location of farms in the valley or in the mountain areas  did not significantly affect seroprevalence values. This result could be partly explained by the fact  that, despite the orographic differences, all the territory of the Province of Parma is in the same  hydrographic area. All the rivers that cross the territory come from the Apennine range and flow in  a north‐east direction up to the Po river. It is interesting to note that only two of the 41 farms included  in the study were completely negative, suggesting a wide dissemination of pathogenic leptospires in  the considered area. Blatti et al. (2011) have hypothesized that the higher seroprevalence detected in  ponies compared to horses could be related to the longer time spent grazing by ponies. A similar  hypothesis was made by other authors to explain the higher prevalence of leptospiral antibody rate  in donkeys compared to horses [32]. However, this study shows that in Bardigiano horses, the risk of  infection is the same regardless of the time the animal spent grazing, turned out or housed in the  stable during the year. The role of the type of housing in Leptospira spp. transmission could be hidden  by the presence or absence of rodents, which represent a major risk factor for Leptospira prevalence  [6,25]. Rodents are probably the predominant type of wildlife in the horsesʹ indoor environment and  the  density  of  the  rat  population  was  positively  associated  with  the  prevalence  of  Leptospira  interrogans  [33].  The  presence  of  pest  control  measures  significantly  reduced  the  chance  for  Bardigiano horses getting the infection. Although the role of rodents in transmission of leptospiral  serovars can sometimes be difficult to evaluate [31], rodent control is considered an important factor  for prevention [6,34] and our data confirm this notion. In this study, the presence of other domestic  animals did not significantly affect the seroprevalence. Domestic animals were mostly dogs, cats and  poultry. Pigs act as maintenance hosts of serovar Pomona [35]. Their presence was reported in only  one farm with the horse living there being negative for all tested serovars. On the other hand, all  Bardigiano horses positive to serovar Hardjo, whose maintenance host is cattle [36], were nearby or  in a cattle farm.  5. Conclusions  This study revealed a high seroprevalence against Leptospira spp. among Bardigiano horses and  a  high  number  of  infected  farms.  Seroprevalence  was  considerably  higher  compared  to  similar  studies carried out in Italy [10,11,19]. Horses living in the considered area, therefore, have high risk  exposure to pathogenic leptospires. However, anamnestic data suggested that in Bardigiano horses,  the infection is mostly subclinical. In agreement with other authors [33], this study showed how  improving some management practices, especially rodent control, might reduce the risk of exposure  for horses and hopefully, for humans.  Author Contributions: conceptualization, F.Q., S.T. and E.V.; methodology, S.T. and E.V.; validation, S.C. and  S.T.; formal analysis, S.T.; investigation, M.A., C.S.C., E.S., J.S., S.T. and E.V.; resources, all authors; data curation,  J.S., S.T. and E.V.; writing—original draft preparation, S.T. and E.V. with support from F.Q.; writing—review  and editing, all authors; visualization, S.T.; funding acquisition, S.C. and F.Q.  Funding: This research was funded by a research fund from the University of Parma (S.C.‐FIL 2016) and by  personal research funding (F.Q.).  Acknowledgments: The authors gratefully acknowledge the Associazione Provinciale Allevatori of the Province  of Parma for providing data on Bardigiano horses and the breeders involved in the study. This research did not  receive any specific grant from funding agencies in the public, commercial, or not‐for‐profit sectors.  Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.    Animals 2020, 10, 23  10  of 11  References  1.  Pappas,  G.;  Papadimitriou,  P.;  Siozopoulou,  V.;  Christou,  L.;  Akritidis,  N.  The  globalization  of  leptospirosis: Worldwide incidence trends. Int. J. Infect. Dis. 2008, 12, 351–357.  2.  Vijayachari, P.; Sugunan, A.P.; Shriram, A.N. Leptospirosis: An emerging global public health problem. J.  Biosci. 2008, 33, 557–569.  3.  Budihal, S.V.; Perwez, K. Leptospirosis Diagnosis: Competancy of Various Laboratory Tests. J. Clin. Diagn.  Res. 2014, 8, 199–202.  4.  Malalana, F. Leptospirosis in horses: A European perspective. Equine Vet. J. 2019, 51, 285–286.  5.  Verma, A.; Stevenson, B.; Adler, B. Leptospirosis in horses. Vet. Microbiol. 2013, 167, 61–66.  6.  Hamond, C.; Pinna, A.; Martins, G.; Lilenbaum, W. The role of leptospirosis in reproductive disorders in  horses. Trop. Anim. Health Prod. 2014, 46, 1–10.  7.  Broux, B.; Torfs, S.; Wegge, B.; Deprez, P.; van Loon, G. Acute respiratory failure caused by Leptospira spp.  in 5 foals. J. Vet. Intern. Med. 2012, 26, 684–687.  8.  Hamond, C.; Martins, G.; Lilenbaum, W. Pulmonary hemorrhage in horses seroreactive to leptospirosis in  Rio de Janeiro, Brazil. J. Vet. Intern. Med. 2012, 26, 1237–1238.  9.  Hendricks, B.L. International Encyclopedia of Horse Breeds; University of Oklahoma Press: Norman, OK, USA,  2007; ISBN 978‐0‐8061‐3884‐8.  10.  Cerri, D.; Ebani, V.V.; Fratini, F.; Pinzauti, P.; Andreani, E. Epidemiology of leptospirosis: Observations on  serological data obtained by a “diagnostic laboratory for leptospirosis” from 1995 to 2001. New Microbiol.  2003, 26, 383–389.  11.  Ebani, V.V.; Bertelloni, F.; Pinzauti, P.; Cerri, D. Seroprevalence of Leptospira spp. and Borrelia burgdorferi  sensu lato in Italian horses. Ann. Agric. Environ. Med. 2012, 19, 237–240.  12.  Niloofa,  R.;  Fernando,  N.;  de  Silva,  N.L.;  Karunanayake,  L.;  Wickramasinghe,  H.;  Dikmadugoda,  N.;  Premawansa, G.; Wickramasinghe, R.; de Silva, H.J.; Premawansa, S.; et al. Diagnosis of Leptospirosis:  Comparison  between  Microscopic  Agglutination  Test,  IgM‐ELISA  and  IgM  Rapid  Immunochromatography Test. PLoS ONE 2015, 10, e0129236.  13.  Arent, Z.; Gilmore, C.; Brem, S.; Ellis, W.A. Molecular studies on European equine isolates of Leptospira  interrogans serovars Bratislava and Muenchen. Infect. Genet. Evol. 2015, 34, 26–31.  14.  Houwers, D.J.; Goris, M.G.A.; Abdoel, T.; Kas, J.A.; Knobbe, S.S.; van Dongen, A.M.; Westerduin, F.E.;  Klein, W.R.; Hartskeerl, R.A. Agglutinating antibodies against pathogenic Leptospira in healthy dogs and  horses indicate common exposure and regular occurrence of subclinical infections. Vet. Microbiol. 2011, 148,  449–451.  15.  Blatti, S.; Overesch, G.; Gerber, V.; Frey, J.; Hüssy, D. Seroprevalence of Leptospira spp. in clinically healthy  horses in Switzerland. Schweiz. Arch. Tierheilkd. 2011, 153, 449–456.  16.  Hamond, C.; Martins, G.; Lilenbaum, W. Subclinical  leptospirosis may  impair athletic performance  in  racing horses. Trop. Anim. Health Prod. 2012, 44, 1927–1930.  17.  Trimble,  A.C.;  Blevins,  C.A.;  Beard,  L.A.;  Deforno,  A.R.;  Davis,  E.G.  Seroprevalence,  frequency  of  leptospiuria, and associated risk factors in horses in Kansas, Missouri, and Nebraska from 2016–2017. PLoS  ONE 2018, 13, e0206639.  18.  Raghavan, R.K.; Brenner, K.M.; Higgins, J.J.; Hutchinson, J.M.S.; Harkin, K.R. Evaluations of hydrologic  risk factors for canine leptospirosis: 94 cases (2002–2009). Prev. Vet. Med. 2012, 107, 105–109.  19.  Tagliabue, S.; Figarolli, B.M.; D’Incau, M.; Foschi, G.; Gennero, M.S.; Giordani, R.; Giordani, R.; Natale, A.;  Papa, P.; Ponti, N.; et al. Serological surveillance of Leptospirosis in Italy: Two‐year national data (2010– 2011). Vet. Ital. 2016, 52, 129–138.  20.  Bertelloni, F.; Cilia, G.; Turchi, B.; Pinzauti, P.; Cerri, D.; Fratini, F. Epidemiology of leptospirosis in North‐ Central Italy: Fifteen years of serological data (2002–2016). Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2019, 65,  14–22.  21.  Båverud,  V.;  Gunnarsson,  A.;  Engvall,  E.O.;  Franzén,  P.;  Egenvall,  A.  Leptospira  seroprevalence  and  associations between seropositivity, clinical disease and host factors in horses. Acta Vet. Scand. 2009, 51, 15.  22.  Divers, T.J.; Chang, Y.‐F.; Irby, N.L.; Smith, J.L.; Carter, C.N. Leptospirosis: An important infectious disease  in North American horses. Equine Vet. J. 2019, 51, 287–292.  23.  Arent, Z.; Frizzell, C.; Gilmore, C.; Allen, A.; Ellis, W.A. Leptospira interrogans serovars Bratislava and  Muenchen animal infections: Implications for epidemiology and control. Vet. Microbiol. 2016, 190, 19–26.  Animals 2020, 10, 23  11  of  11  24.  Rocha, T.; Ellis, W.A.; Montgomery, J.; Gilmore, C.; Regalla, J.; Brem, S. Microbiological and serological  study of leptospirosis in horses at slaughter: First isolations. Res. Vet. Sci. 2004, 76, 199–202.  25.  Levett, P.N. Leptospirosis. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14, 296–326.  26.  Gilger, B.C.; Deeg, C. Equine Recurrent Uveitis. In Equine Ophthalmology, 2nd ed.; Gilger, B.C., Ed.; W.B.  Saunders: Saint Louis, MO, USA., 2011; pp. 317–349. ISBN 978‐1‐4377‐0846‐2.  27.  Malalana, F.; Blundell, R.J.; Pinchbeck, G.L.; Mcgowan, C.M. The role of Leptospira spp. in horses affected  with recurrent uveitis in the UK. Equine Vet. J. 2017, 49, 706–709.  28.  Sauvage, A.C.; Monclin, S.J.; Elansary, M.; Hansen, P.; Grauwels, M.F. Detection of intraocular Leptospira  spp. by real‐time polymerase chain reaction in horses with recurrent uveitis in Belgium. Equine Vet. J. 2019,  51, 299–303.  29.  Dwyer, A.E. The Many Faces of Uveitis. In Proceedings of the 14th International Congress of the World  Equine Veterinary Association WEVA, Guadalajara, México, 8–10 October 2015; pp. 1–6, Lecture 4.  30.  Wangdi, C.; Picard, J.; Tan, R.; Condon, F.; Dowling, B.; Gummow, B. Equine  leptospirosis  in tropical  Northern Queensland. Aust. Vet. J. 2013, 91, 190–197.  31.  Simbizi, V.; Saulez, M.N.; Potts, A.; Lötter, C.; Gummow, B. A study of leptospirosis in South African horses  and associated risk factors. Prev. Vet. Med. 2016, 134, 6–15.  32.  Hajikolaei, M.R.H.; Gorbanpour, M.; Haidari, M.; Abdollapour, G. Comparison of leptospiral infection in  the horse and donkey. Bull Vet Inst Pulawy. 2005, 49, 175–178.  33.  Barwick,  R.S.;  Mohammed,  H.O.;  McDonough,  P.L.;  White,  M.E.  Epidemiologic  features  of  equine  Leptospira interrogans of human significance. Prev. Vet. Med. 1998, 36, 153–165.  34.  Tsegay, K.; Potts, A.D.; Aklilu, N.; Lötter, C.; Gummow, B. Circulating serovars of Leptospira in cart horses  of central and southern Ethiopia and associated risk factors. Prev. Vet. Med. 2016, 125, 106–115.  35.  Wasiński, B.; Pejsak, Z. Occurrence of leptospiral infections in swine population in Poland evaluated by  ELISA and microscopic agglutination test. Pol. J. Vet. Sci. 2010, 13, 695–699.  36.  Lilenbaum, W.; Martins, G. Leptospirosis in cattle: A challenging scenario for the understanding of the  epidemiology. Transbound Emerg Dis. 2014, 61, 63–68.    © 2019 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access  article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution  (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).