EA1810.indd 464 A r S T I T E A DUSKONN A A A S TA PÄ E V Eesti Arst 2018; 97(9):464–471 Mikrobioota – inimese vältimatu partner Agu Tamm – Tartu Ülikooli emeriitprofessor Akadeemiline loeng Tartu Ülikooli arstiteaduskonna 386. aastapäevale pühendatud teaduskonverentsil 11. oktoobril 2018 Agu Tamm I n i m e s e m i k r o b i o o t a k s ( M B ) n i m e t a- takse inimkeha kõikide mikroorganismide kog umit. A r v utuslik ult on neid niisama palju kui inimkeha muid rakke (1 : 1). Seega pakuvad uurimused rikkalikult detaile, aga vähem üldisi vaateid, MB-töödes dominee- rivad enamasti mõju negatiivsed aspektid. Ka autor i enda v arasemad uur i ng ud on pi irdu nud soole m i k rof loora a k ti ivsuse suurenemise ning vähiriski ja toitainete imendumise häirete seoste uurimisega. Tänu uute meetodite kasutuselevõtule o n v i i m a s e l a a s t a k ü m n e l p l a h v a t u s l i- kult aktiveerunud mikrobiaalsete mõjude uurimine inimesel. Verstapostidena sellel teel peaks nimetama kaht suurt projekti: USA National Institutes of Health Human Microbiome Project ( HMP 2007) ja Euroopa Liidu seitsmenda raamprogrammi projekt Metagenomics of the Human Intestinal Tract ( MetaHIT 2008). Mikrobioomiks nimeta- ta k se kõi k ide nende m i k roorga n ism ide genoomide kogumit. See suhe olevat (1) inimese genoomiga võrreldes 1 : 150 mikro- bioota kasuks! Mõlema projekti eesmärgiks seati uurida meie kehas ja kehal elavate mikroobide kogu- kondi ning selgitada nende rolli inimeste te r v i s ele ja h a ig u s tele. H M Ps k ä sit le t i mikroobe enam kui 15 paikmest, sh nahalt ja igemetaskutest kuni tupe tagumise võlvini. Me t a HI T-s keskendut i sooles t i k u le k u i mikroobide suurimale reservuaarile, selle seostele kahe Euroopas olulise häirega – põletikulise soolehaigusega (inflammatory bowel disease, IBD) ja rasvumisega. Olulise tulemusena suudeti isikuid väljaheiteproo- v ide me t age no om i l i s e s e k ve ne e r i m i s e alusel (1) rühmitada ühte kolmest entero- tüübist, mis on määratletud domineeriva mikroobi perekonna Bacteroid’i, Prevotella või Ruminococcus’e alusel (2, 3). Teised uurijad on soovitanud liigitada uuritavaid isikuid vastavalt nende mikrobioomide geneetilisele n-ö liigirikkusele: kas arvukus on alla või üle 480 000 geeni (4). Vaesemat MBd on leitud soolepõletikuga haigetel ja rasvunutel. U U E D U U r I M I S M E E T O D I D V i i ma sel aa st a k ü m nel on m i k robioom i uurimise meetodeid – lisaks klassikalistele k u lt uu r idele – a rendat ud kol mes põh i- suunas: DNA järjestuse uuringud (16S rRNA, DNA nn hajus tulistamine, ingl shotgun), RNA ekspressiooni uuring ud ja väikeste molek u l ide uu r i ng ud (metaboloom i k a). Senini on esiplaanil olnud püüdlused selgi- tada, millised organisme võib leida sooles ja m i l l i ne on nende su htel i ne a r v u k us, vähem on uuritud, millised on selle koosluse funktsioonid. M i k r obioom i uu r i mu sed on a nd nud rohkesti infot metaboolsete radade kohta sooles. On suudetud kirjeldada vähemalt 50 metaboolset rada MB kui koosluse genoomis, näiteks lak toosi ja teiste suhk r ute ning aromaatsete aminohapete lammutamisest k u n i Fe( II ) ok südatsioon i n i. Ük s nende geneetiliste meetodite suurimaid puudusi on, et ei suudeta näidata isiku MB tegelikku metaboolset aktiivsust, kuna tuvastatakse nii ekspresseeritud kui ka mitteekspres- seeritud geene. Infot võib genereerida ka surnud rakkudest (5). Samas on teada, et rohkem kui pooled roojaproovides olevatest rakkudest ei ole elujõulised või on tugevalt kahjustatud. Kui RNA-põhiselt rakke sortida ning MB mikroobide koguarvu ja aktiivseid populatsioone eristada, võib leida suuri erinevusi. Seetõttu, kui kasutatakse töötle- mata roojaproove, ei tohiks funktsionaalset mikrobioomi tuletada ainuüksi DNA-põhiste eksperimentide andmete testide alusel (6). Seev ast u v ä i keste molek u l ide uur i m i ne 465 A r S T I T E A DUSKONN A A A S TA PÄ E V Eesti Arst 2018; 97(9):464–471 ( lühikese ahelaga rasvhapped, fenoolid, polüamiinid, H2, CH4 jpt) annab küllaltki hea kvantitatiivse ülevaate toimuvast konk- reetsel isikul. Kokkuvõttes on metaboloomi uuringud osutanud MB mõjule vähemalt 5 koele-elun- dile (sool, maks, aju, rasvkude, skeletilihas), kuid ka energia ainevahetusele ja paljudele immuunprotsessidele. Samas tuleb arves- tada inimese MB koostise tohutut indivi- duaalset erinev ust (7). S O O L E M I K r O B I O O TA JA P E r E M E h E D I E E T Tundub loogiline, et esmane küsimus on ikka, milline on dieedi mõju soole MB-le, ja sealt edasi, kas MB kaudu saaks mõjus- tada peremeest. On selge, et sama dieet ei mõjusta erinevaid inimesi ühtviisi. Kui võrreldi geneetiliselt rasvunud hiirte soolte MBd nende la hjade pesa kon na kaaslaste omaga, samuti rasv unud ja lahjasid vaba- ta htl i k ke i n i mesi, selg us, et ras v u m i ne on seotud kahe domineeriva bakteriaalse hõimkonna Bacteroidetes’e ja Firmicutes’e suhtelise ar v uk use muutustega. Ilmnes, et rasvunu mikrobioomil on suurem võime saada dieedist energiat. Enamgi, see tunnus osut u s ü lek a nt av a k s: k u i idu v abu h i i r i kolon i seer ida r a s v u nud i n i mese MBg a, s uu r end ab see nende h i i r te keh a r a s v a kogust oluliselt enam kui n-ö lahja MBga kolon i seer i m i ne (8 ). Ta a n l a s tel teht ud uurimus näitas, et inimese rasv umisega seotud signaal seedetrakti mikrobioomist võib olla palju tugevam kui inimese praegu teadaolevast genoomist saadav signaal, kui püütakse eristada rohke ja vähese geeni- arv uga isikuid (4). Praktilise rakendusena: sel osal rasv unuist, kelle organism allub püüdlustele kehakaalu vähendada mingit tüüpi dieediga, on MB geenisagedus väiksem ja suurema variaablusega. Ühek s soole m i k robioom i uu r i ng ute silmapaistvaks tulemuseks on Akkermansia muciniphila lug u. A. muciniphila avastati 2004. aastal. Uue generatsiooni uuringute alusel osutus ta kõige arvukamaks üksiklii- giks inimese sooles (0,5–5% kogu bakterite hulgast). Ta on gramnegatiivne anaeroobne bakter, spoore ei moodusta ja on spetsia- liseerunud lima kasutamisele. Kui teda on vähe, on soole limakiht õhem, kuid enam on rasvumust, diabeeti, kardiometaboolseid haigusi ja madala intensiivsusega põletikku (9). Arv ukatel prekliinilistel mudelitel on näidatud, et A. muciniphila manustamine kaitseb hiiri toidust põhjustatud rasvumise eest, suurendab soole limaskesta barjääri funktsiooni ja vähendab insuliiniresistent- sust, samuti soole- ja süsteemset põletikku (10). A. muciniphila välismembraanis esinev spetsiifiline valk (A muc_1100), millel on samasugune toime kui bakteril, võib osutuda tugevaks kandidaadiks edasiste ravimite väljatöötamiseks ja sel rav imil oleks lai kasutusvaldkond. M I K r O B I O O TA JA A L AT O I T L U S K VA Š I O r KO r I N Ä I T E L Nagu teada, pole maailma tervishoiu suurim probleem ülekaalulisus, vaid nälg. Esimestel eluaastatel on suurim lapse surma põhjus- taja alatoitumus. Kvašiorkor, tõsine ägeda alatoitluse salapärane vorm, on ebapiisavate toitainete tarbimise ja täiendava keskkonna- koormuse tagajärg. On selgunud, et üksnes kasutusvalmis terapeutiline toidu ( KV TT ) laialdasest rakendamisest ei piisa suremuse vältimiseks (11). Toidu mõju, ükskõik kui rikas see on, sõltub olulisel määral vastu- võtva peremehe soolestiku mikroobidest, mis võivad muutuda ka vaenulikuks (12, 13). Ma law i on ü k s sel l i seid m a id, k u s u mb es 46 pr ot sent i a l l a v i iea a s t a s tes t lastest on kängu jäänud, 21 protsenti on alakaalulised. Leiti, et amoksitsilliini või tsefdiniiri lisamine KV TT-le kvašiorkoriga laste ravis parandas märgatavalt taastumist, vähendas suremust ja suurendas kehakaalu. R av iefek t i selg itades uu r it i 317 Ma law i ka k si k ute paar i, kel lest 43%-l ol i K V T T lahkneva raviefektiga (14). Kui lahkevate tulemustega kaksikute fekaalset MBd siirati gnotobiootilistele hiirtele, ilmnes, et Malawi toidul oleva kvašiorkori MB põhjustas retsi- pienthiir tel märk imisväärset kehakaalu kaotust, millega kaasnesid häired aminoha- pete ja süsivesikute metabolismis. Selleks, et kaalukaotust vältida, pidi MBs leiduma mikroobide kombinatsioon (R. gnavus + C. symbiosum), mis soodustaks insuliinisarnase kasvufaktori produktsiooni (13). Need leiud viitavad soolestiku MB-le kui kvašiorkorit põhjustavale teguritele. Tugeva alatoitluse rav i a nt ibioot i k u m idega võib mõjutada selle inimese MB koostist, et soodustada toitainete paremat kasutamist. M I K r O B I O O TA JA A JU P r e k l i i n i l i s e d j a k l i i n i l i s e d u u r i n g u d on nä ida nud k a hesuu na l ist koostoi met 466 A r S T I T E A DUSKONN A A A S TA PÄ E V Eesti Arst 2018; 97(9):464–471 aju-soole-m ik robioom i teljel. Soolestik u mik roobid edastavad impulsse kesk när- v isüsteemi ( KNS) vähemalt kolme paral- leelse ja interak tiivse kanali kaudu, mis hõlmavad närvisüsteemi, sisesekretsiooni ja immuunsüsteemi signaale. Aju võib mõju- tada soolestiku mikrobiootika koostist ja f u n k tsioon i autonoomse nä r v isüsteem i kaudu, modu leer ides teat ud sooleosade motoorikat, soolepassaaži ja -sekretsiooni ning soole limaskesta läbilaskv ust, samuti ( potentsiaalselt) hormoonide luminaalse sek retsiooni kaudu, k ui moduleeritakse otseselt mikroobset geeniekspressiooni. P r ek l i i n i l i s e d uu r i ng ud k i r jeld av ad seost soole-mikrobioomi ja ärritatud soole s ü nd r o om i ja r a s v u m i s e v a hel , ag a k a seoseid mitmete psühhiaatriliste ja neuro- loogiliste haig uste patogeneesi tasandil (15). Selliseid varasemaid viiteid enamasti ignoreeriti, kuni Sudo kaasautoritega (16) nä itas 20 04. aasta l esi mesena, et soole normaalse MB puudumine varajases eas mõjutab märk imisväärselt täiskasvanud hiire stressitundlikkust ja et neid muutusi võib osaliselt vähendada soolestiku varajase koloniseerimisega tavapärase MBga, isegi ühe liigiga. Edasised uuringud on iseloomustanud MBst lähtuvaid neurokeemilisi muutusi. Muut ub aju koore ja h ipoka mpuse poolt toodetud neurotroopsete faktorite tase, väheneb hipokampuse serotoniini (5-HT ) r e t s e p tor i 1 A e k s pr e s s i o o n , s u u r e n eb vöötkeha monoamiini käive ja sünapsite plastilisus väheneb (17, 18). KNSi ja mikro- bioota suhtlust vahendavad mitmesugused mikroobide toodetud molekulid, sh lühikese ahelaga rasvhapped, sekundaarsed sapp- happed ja trüptofaani metaboliidid. MB võib iseseisvalt toota või kaasa aidata mitmete neuroaktiivsete molekulide, sealhulgas, kuid mitte ainult γ-aminovõihappe, serotoniini, noradrenaliin i ja dopam iin i tootm isele. Siiski pole seni teada, kas virgatsid jõuavad a sja koh a s tes s e r e t s e ptor ites s e või k a s saav utavad piisava taseme, et peremehel reaktsiooni esile kutsuda. Mitmete psühhiaatriliste (depressioon, ärevus) ja neuroloogiliste haiguste (Parkin- soni tõbi, autismispektri häired) puhul kaas- nevad patsientidel märkimisväärsed seede- traktivaevused. Seetõttu viitavad hiljutised uuringud soolestiku MB tähtsusele mitte ainult gastrointestinaalsete sümptomite patofüsioloogias, vaid ka MB potentsiaal- sele rollile esmases haiguses. Kaks erinevat tüüpi uuringut võiksid viidata põhjuslikule seosele. Esiteks, E. coli alatüüpide puhangud v iisid tabandatud elanikkonnas Kanadas ja Saksamaal depressioonist ja ärev usest põhju st at ud sü mptom ite sagenem i sen i (19). Teiseks, depressiivse inimese väljaheite mikroobide transplantatsioonid põhjustasid rotimudelites depressiivset käitumist (20). Võimalikule põhjuslikule seosele viitavad need andmed, mis näitavad, et Parkinsoni tõve mudeli närilistel suurenevad liikumis- häired, kui neile üle kanda Parkinsoni tõvega patsientide MB, aga seda toimet ei ole, kui üle kanda tervete kontrolliisikute MB (21). Sel juhul võivad seedetrakti sümptomid olla juba haiguse prodroomiks. Selline võimalus muudab soolestiku MB paljutõotavaks teabe- allikaks Parkinsoni tõve diagnoosimisel ja prognoosimisel. Kokkuvõttes, kliiniliste andmete kogu- nedes võib selg uda MB m it mekesi ne ja oluline mõju KNSi fenotüüpidele. Mõiste- tavalt on käimas olevate teadusuuringute eesmärk tuvastada uusi ravimärklaudu ja töötada välja ravistrateegiaid. M I K r O B I O O TA JA K A r T S I N O G E N E E S A r ves t ades soole m i k r of loor a ü l i s uu r t metaboolset võimekust, on ammu arvatud, et mõnel ju hu l suuda k s m ik rof loora ka kok a r tsi nogeene toota ( 22). Si isk i pole sellised otsese teg uri otsing ud suutnud selgitada soolevähi teket isegi perekondliku polüpoosi korral. A lles v iimastel aastatel, kui on fekaalse MB kõrval hakatud uurima jämesoole limaskestaga seotud mikroobe (23) või mikrobioome (24), on tek k inud selgem ettek ujutus jämesoolevähi pato- geneesi s t . Dejea k a a sautor iteg a ( 2018 ) t uv astas perekond l i k u adenomatoosiga patsientide jämesoole limaskestal koldelisi ba k ter iaa l seid biof i l me, m i s koosnesid peamiselt Escherichia coli’st ja Bacteroides fragilis’est. Võrreldes ter vete inimestega oli patsientide jämesoole limaskestal väga rikkalikult geene, mis kodeerivad onko- tok si i n ide sek ret sioon i ( kol iba k t i i n i ja Bacteroides fragilis’e toksiini). Tuumorile v a s t u võt l i ke h i i r te kokolon i s e e r i m i ne nende k a he t üvega suu rendas i nterleu- kiin-17 sisaldust sooles ja DNA kahjustust soolepiteelis. Neil hiirtel kiirenes kasvaja tekkimine ja suurenes suremus, võrreldes ainult ühe bak teritüvega koloniseeritud 467 A r S T I T E A DUSKONN A A A S TA PÄ E V Eesti Arst 2018; 97(9):464–471 hiirtega. Seega, tuumori tekkeks on vaja mitme kahjustava teguri üheaegset toimet otse l i maskesta le, l isa k s mõjutab orga- nismi veel peremeesorganismi geneetiline eelsoodumus haiguse suhtes. A n a lo og ne on ol nu d m aov ä h i p ato - geneesi selg ita m i ne. Helicobacter pylori krooniline infektsioon on kõige tugevam teadaolev riskitegur mao adenokartsinoomi tekkeks, kuid siiski mitte ainus. Üllatusena on mikrobioomi uuringud tõestanud mao limaskesta rohket kolonisatsiooni (8 hõim- konna mikroobidega!), viidates H. pylori’le kui olulisele mao MB regulaatorile (25). H. pylori on gramnegatiivne bakter, mis selektiivselt koloniseerib mao epiteeli ja mida peetakse mao MB endogeenseks liik- meks, sest populatsioonides on 30–94% (26) nakatunud H. pylori’ga. Samas vaid 1–3%-l H. pylori’ga koloniseeritud isikutest areneb mao adenokartsinoom (27, 28). Selles prot- sessis on vaja arvestada nii H. pylori tüvede erineva virulentsuse ja adhesiivsusega kui ka peremehe interleukiini1-beeta ja tuumori nek roosi f a k tor-a l f a polü mor f i sm ideg a, samuti keskkonnateguritega nagu suure soolasisaldusega ja rauavaene dieet. Seega, olukordi, kus MB seostub pere- mehe haiguste riski suurenemisega või häire tekkega, tuleks käsitleda kui kõrvalekallet MB ja peremehe vastastikusest kasulikust koostööst (29). M I K r O B I O O TA P O S I T I I V N E M ÕJU O n l e i t u d , e t s o ol e m i k r o ob i d t o o v a d peremehele kasu õige mitmel viisil. Nende seni teadaolevad soodsad mõjud hõlmavad järgmisi protsesse (8): • soodustatakse kasulike toidukomponen- tide muundamist ja hõlbustatakse nende kasutuselevõtmist; • valmistatakse kasulikke fermentatsioo- niprodukte, mis mõjutavad soolesisaldise pH-d ja mõjustav ad soole l imaskesta epiteelirakke; • tõrjutakse välja patogeene, konkuree- rides nendega kinnituskohtade pärast soole limaskestal; • vastastikustes mõjutustes soole immuun- süsteemiga aidatakse kaasa nii loomuliku kui ka omandatud immuunfunktsiooni kujunemisele ja reguleerimisele; • mü rg i seid a i neid k a s muu nd at a k se, lahjendatakse või eemaldatakse; • väljaheite hulga moodustamises osaledes vähendatakse mao-soole passaaži aega. KO O S T Ö Ö VA JA D U S M I K r O B I O O TA U U r I M I S E L JA r A K E N D A M I S E L MB seoste ja võimalike mõjude tulemusliku uurimistöö üks eeldusi on erialade koostöö. Ülalpool kõneks olevais MB uurimise metoo- dikais tunnevad end mugavamalt preklii- niliste erialade spetsialistid, kuid kaugem eesmä rk on t u lemu si saada k l i i n i l i stes olukordades, mida valdavad täies ulatuses üksnes nende erialade spetsialistid. Täna- päevase teadustöö üldine tendents aga on pea igal alal süvenemine üpris kitsale lõigule omaenda er ia la s. Pa r i ma lõppt u lemu se saav utamiseks on aga vaja käsitluse konk- reetsust võimalikult kõigis valdkondades. Kuna suur osa ( kuni 80%) MBst on seni osutunud mittekultiveeritavaks, on kultuu- rist sõltumatute molekulaarsete meetodi- tega saadud palju uusi teadmisi soolestiku MB koostise ja mitmekesisuse kohta. On ilmnenud, et inimese soole MB on veelgi keerulisem ökosüsteem, kui varem eeldati. Enamik kultuurist sõltumatutest meeto- ditest tuginevad väga konser vatiivse 16S ribosomaalse RNA (rRNA) geeni järjestusele bakteritel ja arhedel. A ndmete hiiglaslik hulk omakorda nõuab mikrokiipide kasu- tamist ning uusi biostatistika meetodeid. Samas peab arvestama, et vaatamata oma nimetatud eelistele ei suuda metagenoomika määrata mikroobse geeni ekspressiooni. Soolesti k u m i k robioom i f u n k tsionaa lse aktiivsuse määramiseks on vaja kasutada teisi meetodeid nagu ainevahetuse vahe- ja lõpp-produk tide määramist (metaboloo- mika). M I K r O B I O O TA JA T S Ü K L I L I S T E A M I N O h A P E T E M E TA B O L I I D I D N E E r U h A I G U S T E N Ä I T E L Alljärgnevalt on püütud viidata vajadusele taotleda konkreetsust nii meetodites, ekspe- rimendi seadetes, kliinilistes andmetes kui ka terminites. Aastakümneid olid teada ja kliinilistes uu r i ng utes r a kendat ud sel l ised soolest p ä r i n e v a d b a k t e r i a a l s e d m e t a b ol i i d i d nagu indool ja p-kresool. Neid tunti tüüpi- liste ureemia toksiinidena. Samas ei seos- tatud nende tekkimist kindlate mikroobi- dega ega aminohapetega, vaid lihtsalt nn valkude bak teriaalse fermentatsiooniga. Siis aga selgus, et nende ühendite suurem sisaldus veres seostub kroonilise neeruhai- gusega patsientide suurema suremusega südame-veresoonkonnahaigustesse (30, 31). 468 A r S T I T E A DUSKONN A A A S TA PÄ E V Eesti Arst 2018; 97(9):464–471 Järgneval põhjalikumal analüüsil osutus p-kresool selliste südame-veresoonkonna- haiguste ennustajaks, mis ei sõltunud ei glomerulaarsest filtratsioonikiirusest ega traditsioonilistest Framinghami risk ite- guritest (32). Autorid küll ei teadnud, kas p-kresool kui kardiovaskulaarne riskitegur on pat sient idel mod i f it seer it av. Va st av katse prebiootilise oligofr uk toosinuliini manustamisega 4 nädala jooksul vähendas oluliselt p-kresüülsulfaadi tekkimise kiirust ja seerumi kontsentratsiooni hemodialüü- sipatsient idel. Sa ma l aja l i ndok süü lsu l- faadi vastavad näitajad märkimisväärselt ei muutunud (33). Nende leidude põhjal järeldasid autorid, et indoksüülsulfaat ja p-k resüü lsu lfaat pärinevad teineteisega m it teseot ud ba k ter iaa l se a i ne v a het u se radadelt, jättes lahtiseks küsimuse nende produktide potentsiaalsetest tootjatest. I ndool ig a er i l i s t v a id lu s t ei tek i, e t selle tootjad on paljud indoolpositiivsed mikroobid, mille toksiline produkt sulfa- teer it a k se m a k sa s. P-k r esool ig a ol i a si keerukam. Selle artikli autori töörühm on juba varem avaldanud andmed türosiini kohta n ing p-hüdrok sü-fenüü lääd ik hap- pest p-kresooli tootvate mikroobide kohta nii in vitro (22, 34, 35) kui ka in vivo (36, 37). Töörühm leidis rohkem seoseid katse- loomade soole limaskestal resideeruvate mikroobidega kui soolevalendiku mikroobi- dega. P-kreooli eeldatavate produtseerijate hulgas on nii aeroobe nagu stafülokokid kui ka anaeroobe nagu klostriidid, bakteroidid ja bifidobakterid (22, 37, 38). Bakke (39) on postuleerinud, et efektiivseks tootmiseks olgu vastavaid mikroobiliike keskkonnas kaks, kuna protsess kulgeb vaheühendite kaudu. Erineva ja selektiivse toimespekt- riga antibiootikumide manustamise järel käitusid p-kresool ja indool täiesti erine- valt, mistõttu on alust kinnitada, et nende tootjad on valdavalt erinevad (36). Hilju- tised ülevaated tõendasid, et p-k resooli tootjad paigutuvad hõimkonda Firmicutes (Clostridia, Ruminococcaceae jms), indool- positiivseid aga leidub lisaks veel 5 muus hõimkonnas (40). Saito 2018. aasta in vitro katsetes täpsustati, et p-kresooli tootsid rohkesti Coriobacteriaceae ja Clostridium’i klastritest XI ja XIVa testitud liigid, teised liigid vähem (41). Kui siia lisada, et just Clostridium’i klastri XIVa rühm võib moodus- tada kuni 60% limakihiga kinnitatud MBst, siis saame taas viite jämesoole limaskesta MB spetsiifilise rolli kohta, kuid ka täpsema määratluse, kust otsida p-kresooli tootjaid. Teiseks on niisama oluline k liiniliste a n d m e t e ko n k r e e t s u s . A l lp o ol m õ n e d vastavad näited. Neeruhaiguste puhul on selged kriteeriumid haiguse raskuse kohta. Neid staadiume tuleb uurijail seoste otsi- misel kindlasti arvestada. Annab ju metabo- liitide määramine hetkeseisu biokeemiliste sündmuste kohta kroonilise neeruhaiguse prog resseer u m isel. Sha h ja kaasautorid (42) tuvastasid läbilõikelises metaboliitide uuringus, et plasma metaboliitide profiilid on 2., 3. ja 4. faasis kroonilistel neeruhaigetel oluliselt erinevad. Muutused puudutasid a rg i n i i n i a i ne v a he t u s t, koag u l at sioon i ja põleti k u suurenem ist, karbok sü laad i anioonide transportimist ja steroidhormoo- nide tootmise vähenemist neerupealistes. Nende erinevuste arvestamisega võib jõuda neeruhaigustega seotud etapispetsiifiliste biomarkeriteni. Rhee kaasautoritega (43), kasutades plasmaproove 1434-lt Framing- hami uuringus osalenud inimeselt, kellel 8 aastat varem polnud kroonilise neeruhai- guse tunnuseid, leidis, et haiguse ilmumist võib prognoosida ainult 9 metaboliidi alusel ( kromato-mass-spektromeetriline määra- mine). Siinkohal tuleb ka lisada, et ainult osa neist metaboliitidest pärinesid MBst, ülejäänud aga peremehe ainevahetusest. Seega, üht olulist faktorit – MB korrelat- sioone – uurides ei või tähelepanuta jätta ka muid samal ajal toimivaid tegureid. Poesen kaasautoritega (44) uuris samal aja l nelja r ü h m a ( hemod ia lüü si saav ad patsiendid, ter ved isikud, vanusega sobi- tatud terved ja isikud, kes sõid sama toitu ko du s). Ku ig i hemo d i a lüü si ja mõlem a ter ve kontrollrühmaga patsientide välja- heiteprof iilid eristusid selgesti, vähenes see erinev us sama toitumisharjumusega leibkon n a t u lemu s te a r vesse võt m i sel . Seevastu ilmnesid märkimisväärsed erine- v used rottide väljaheiteproov ide vahel 6 nädalat pärast 5/6-nefrektoomiat, võrreldes nefrektoomiata opereeritud rottidega ning see viitab siiski sõltumatule neerufunkt- siooni kahjustuse mõjule katseloomadel. Seega saab seostada kroonilist neeruhai- g u st jä mesoole spe t si i f i l i se m i k roobse ainevahetusega, k uigi neer ufunk tsiooni kahjustuse mõju inimesel võib iseenesest olla vähema tähtsusega võrreldes toidu ja muude neer u ha ig usega seot ud teg ur ite (ravimid, kaasnevad haigused) mõjuga. 469 A r S T I T E A DUSKONN A A A S TA PÄ E V Eesti Arst 2018; 97(9):464–471 S e l ge m a d e r i n e v u s e d s o o l e m i k r o - bioomis ilmnevad lõppstaadiumis neeruhai- guse korral (45). Võrreldes sadu toimivaid taksonoomilisi ühikuid ( Ttü, ingl OTU ), leiti, et patsientidel oli Brachybacterium’i, Cate nibac te r ium ’i , Ente robac te r iac eae, Halomonadaceae, Moraxellaceae, Nesteren- konia, Polyangiaceae, Pseudomonadaceae ja T hiothrix ’i perekon na ta k sonoom i l isi ühikuid tunduvalt enam. Eelmisele viitele analoogses nefrektoomiaga rotikatses leiti ba k ter iaa l se te Tt ü-de suu r i m er i ne v u s ureemiliste ja kontroll-loomade vahel, eriti Lactobacillaceae ja Prevotellaceae perekon- dade vähenemine. Seega esineb ureemia korral soolestiku mikrobioomis ulatuslikke muutusi. Selle nähtuse bioloogiline mõju ei ole teada ja ootab edasist uurimist, et jõuda kliinilise rakenduseni. S e n i j ä ä b k a l a ht i s e k s , k u m b n e i s t muutustest on primaarne, kas düsbiootiline mikrobioom on kroonilise neeruhaiguse põhjus või tagajärg. Kui vastastikuste stimu- latsioonide circulus vitiosus on juba käivi- tunud, genereeritakse suuremas koguses ureemia toksiine sooles. Kuidas neid prot- sesse maha suruda, peavad näitama edas- pidised laiaulatuslikud uuringud, enne kui saab soovitada mõnd meetodit kliiniliselt rakendada (46 ). A meerika Ühendriik ide d iabeed i, seede- ja neer u ha ig uste insti- tuut ( NIDDK ) ongi käivitanud kaks sellist projekti, et kombineerida metagenoomika ja metaboloomika võimalusi neeruhaigete uu r i m isel (47 ). P r aeg u sek s on nä ha, et metagenoomika võimaldab avastada olulisi suundi MB koostises, sh ulatuslikus seni kultiveerimata MB osas, metaboloomika aga dešifreerida seni tundmatuid funkt- sionaalseid seoseid peremeesorganismi ja MB vahel. Siiski tuleb arvestada, et nendel paljutõotavatel meetoditel on nii oma eelised kui ka oma piirangud. T U L E M U S T E S Õ LT U V U S M E E T O D I T E S T Hugon jt (48) võrdlesid tänapäevaseid meeto- deid väljaheite MB uurimisel. Nende analüüs hõlmas Grami järgi värvimist, voolutsüto- meetriat, transmissioon-elektronmikroskoo- piat ( TEM ), Bacteroidetes’e ja Firmicutes’e hõimkonna kvantitatiivset reaalajalist PCRi (qPCR) ja V6-pi i rkon n a le suu n at ud 16S rRNA geenimaterjali pürosekveneerimist. Autorite arvates näitas uuring, et inimese soole mikrobioota kogu mitmekesisus ei ole teada, sest erinevate tehnikatega saadakse väga erinevaid t ulemusi. Nad järeldasid põhjendatult, et bakterikogukondade üldise koostise hindamiseks tuleb kombineerida mitmeid meetodeid ja et igast meetodist tulenevate lahknevuste tundmine võiks olla kasulik molekulaarsete uuringutega leitud oluliste erinev uste selgitamisel. KO N K r E E T S U S T JA TÄ P S U S T K A T E r M I N I T E S Lõpuks on soov itatav taotleda konkreet- sust ja täpsust ka terminites. Planeeritud rahvusvahelisi projekte nimetatakse „hästi määratletud uuringuteks“ (47). Nende jälgi- tavust soodustab konkreetsus ka terminites. Ka käesolevas tekstis on eespool sageli kasu- tatud soole mikrobioota sünonüümina välja- heite materjali MBga, nagu paljud autorid kasutavad. Tegelikult on siiski tegemist vaid jämesoole valendiku distaalse osa MBga, mis on kõige kergemini kättesaadav materjal. Samas võib väljaheitest saadud MB uurimise t u lemu s er i neda jä mesoole l i maskest a l limakihis resideeruvast kooslusest, kindlasti erineb see suuresti peensoole MBst. Nii ongi selle artikli sissejuhatuses kirjeldatud MB „enterotüüpe“ soov itatud (49) nimetada pigem „fekot üüpidek s“, sest peensooles domineerivad hoopis perekonnad Strep- tococcus, Clostridium ja Veillonella. M I K r O B I O O TA U U r I M I S E P E r S P E K T I I V I D MB uurimise perspektiividest tuleks nime- tada soovi a) avastada uusi olulisi seoseid, sh positiivseid teineteist toetavaid suhteid MB ja peremeesorganismi vahel; b) mõjus- t ad a M Bd p er emehele soo d sa s suu n a s; c) metoodilisi probleeme, mille lahendamine k iirendaks k liiniliste seoste uurimist ja rakendusi. A r vestades uute andmete rohkust, on uute seni kirjeldamata seoste avastamine ootuspärane. Siis peab ainevahetusradade uurimine näitama uusi sihtmärke, mille kaudu saaks süsteemi mõjustada. Siinkohal oleme tõesti vaid tee hakul. Peamiselt on hästi teada või ma lused mõjustada MBd erineva toimespek triga antibiootik um i- dega. Nende vajaduses akuutsetel juhtudel pole kahtlust. Väga vähe on seni uuritud tegev uste pikaajalisi tagajärgi ja kõrvaltoi- meid, sh antibiootikumide kaugtagajärgi. Kuidas targalt juhtida seda nõrka põleti- kureaktsiooni inimese organismis, mida 470 A r S T I T E A DUSKONN A A A S TA PÄ E V Eesti Arst 2018; 97(9):464–471 seostatakse ka soole MBga ja on tõsise huvi objektiks nii südame-veresoonkonna- kui ka liigesehaig uste pu hu l? Osa t u lev ik u- lo ot u si on p a ndu d pr ebio ot i k u m ide le, mis järgivad looduslikke mõjutusi MB-le. Eeldatakse, et inuliinitüüpi fruktaanidel ja g a la k to-ol igosa h ha r i id idel või k s ol la mõju metaboolse endotokseemia raviks või väikese aktiivsusega põletiku vähendami- seks ülekaalulistel ja rasv unud inimestel (50, 51). Samas ei ole tõenäoline, et üks ja sama prebiootikum (või mis tahes muu faktor) sobib üht v iisi kõikidel juhtudel. Tõendu spõh i ne r av i eeldab v a st av at diagnostikat. Kui praegu on teada, et MBs saab eristada vähemalt 3 põhimõtteliselt erinevat MB tüüpi, siis on ootuspärane, et igale neist võib (võivad) olla ainult temale sobiv(ad) mõjustaja(d). Esimene väga suur probleem on see, kuidas ja millal suude- takse lahendada metood ilised rask used MB ja peremehe suhete hindamisel nüüd, mil tänu keerukatele MB kultiveerimiseta molekulaarsetele tehnikatele on täielikult muutunud ettek ujutus MB koostisest ja rollist. Kas need MB tüübid on inimesel aastatepikku püsivad või saab neid ka muuta soovitavas suunas? Kas nende variantidest sõltub toitainete ja ravimite käsitlus? Alus- tuseks püütakse välja selgitada n-ö ter ve inimese MB koostis. Kuidas def ineerida tervist ja tervet inimest? Kindlasti leitakse siin piirkondlikke ja etnilisi erinev usi. Probleem on seegi, et esialgu käsitletakse nii pre- kui ka probiootikume toidulisandina, mille puhul – erinevalt ravimite testimi- sest – iseg i ju husl i k ustat ud k l i i n i l istes k at se t u stes ü ld se ei uu r it a või m a l i k ke kõrvaltoimeid (52). Kui soovime kasutada teadmisi kolmest MB tüübist, siis selle teabe kasutamiseks on esmalt vaja k liiniliselt rakendatavaid meetodeid nii inimese MB lähteseisundi hindamiseks kui ka ravitule- muste jälgimiseks. Sarnaselt kosmosetea- dustega on siin kindlasti parimaks viisiks laialdane rahv usvaheline koostöö. Nüüdne kiiresti laienev tööpõld ootab vaimukaid uurijaid. K I R JA N D U S 1. Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, et al. A human gut microbial gene c at alogue e s t ablished by met agenomic s equencing. Nature 2010;464:59 – 65. 2. A r umugam M , R ae s J, Pelletier, E et al. Enterot ype s of the human gut microbiome. Nature 2011;473:174 –80. 3. Costea PI, Hildebrand F, Arumugam M, et al. Enterot ypes in the landscape of gut microbial communit y composition. Nat Microbiol 2018;3:8–16. 4. Le Chatelier E, Nielsen T, Qin J, Prifti E, et al. Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers. Nature 2013;500:541– 6. 5. Ottman N, Smidt H, de Vos WM, Belzer C. The function of our microbiota: who is out there and what do they do? Front Cell Infect Microbiol 2012, doi: 10.3389/fcimb.2012.00104 6. Peris- Bondia F, L atorre A , Ar tacho A , Moya A , D'Auria G. The active human gut microbiota differs from the total microbiota. PLoS One 2011;6: e224 48. 7. Vernocchi P, Del Chierico F, Putignani L. Gut microbiota pro - filing: metabolomics based approach to unravel compounds af fecting human health. Front Microbiol 2016;7:114 4. 8. Hullar M A , Burnet t- Har tman A N, L ampe JW. Gut microbes , diet, and cancer. Cancer Treat Res 2014;159:377–99. 9. Cani PD, de Vos WM. Next-generation beneficial microbes: the case of akkermansia muciniphila. Front Microbiol 2017;8:1765. 10. Plov ier H, Ever ard A , Dr uar t C , et al. A pur if ied membr ane protein from A k ker mansia muciniphila or the p as teur ized bacterium improves metabolism in obese and diabetic mice. Nat Med 2017;23:107–113. 11. Trehan I, Goldbach HS, LaGrone LN, et al. Antibiotics as par t of the management of severe acute malnutrition. N Engl J Med 2013;368:425 –35. 12. Ley RE. Nutrition: when guests turn HS. Nature 2013;494:437–8. 13. Chu DM, Aagaard KM. Microbiome: eating for trillions. Nature 2016;532:316 –7. 14. Smith MI, Yatsunenko T, Manar y MJ, et al. Gut microbiomes of Malawian twin pairs discordant for k washiorkor. Science 2013;339:548–54. 15. M ar tin CR , O s adchi y V, K alani A , Emer an A . M ayer E A . T he brain - gut- microbiome axis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol 2018;6:133 – 48. 16. Sudo N, Chida Y, Aiba Y, et al. Postnatal microbial colonization progr am s the hy p oth al amic- pi tui t ar y - adren al s y s tem for stress response in mice. J Physiol 2004;558:263 –75. 17. N e u f e l d K M , K a n g N , B i e n e n s t o c k J , F o s t e r J . A . R e d u c e d anxiet y- like behavior and centr al neurochemical change in germ -free mice. Neurogastroenterol Motil 2011;23:255 – 64. 18. Diaz HR, Wang S, Anuar F, Qian Y, Et al. Normal gut microbiota modulates brain development and behavior. Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108:3047–52. 19. Kelly JR, Clarke G, Cr yan JF, Dinan TG. Brain - gut- microbiota axis: challenges for translation in psychiatr y. Ann Epidemiol 2016A ;26:366 –72. 20. Kelly JR, Borre Y, O' Brien C, et al. Transferring the blues: dep - ression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. J Psychiatr Res 2016;82:109 –18. 21. Sampson TR, Debelius JW, Thron T, et al. Gut microbiota re - gulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson's disease. Cell 2016;167:1469 –80. 22. Bone E, Tamm A , Hill M. The production of urinar y phenols by gut bacteria and their possible role in the caus ation of large bowel cancer. Am J Clin Nutr 1976;12:14 48–54. 23. D e j e a C M , Fa t h i P, C r a i g J M , e t a l . P a t i e n t s w i t h f a m i l i a l adenomatous polyposis harbor colonic biofilms containing tumorigenic bacteria. Science 2018;359:592–7. 24. Thomas AM, Jesus EC, Lopes A, et al. Tissue-associated bacterial alterations in rectal carcinoma patients revealed by16S rRNA communit y profiling. Front Cell Infect Microbiol 2016;6:179. 25. B i k E M , E c k b u r g P B , G i l l S R , e t a l . M o l e c u l a r a n a l y s i s o f the b ac ter ial microbiot a in the hum an s tom ach. PN A S US 2006;103:732–7. 26. Eusebi LH, Zagari RM, Bazzoli F. Epidemiology of Helicobacter pylori infection. Helicobacter 2014;Suppl 1:1–5. 27. Mégraud F, Bessède E, Varon C. Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma. Clin Microbiol Infect 2015;11:984 –90. 28. Wroblewski LE, Peek RM Jr, Coburn L A . The role of the micro - biome in gas trointes tinal cancer. Gas troenterol Clin Nor th Am 2016;45:543 –56. 29. Candela M, Turroni S, Biagi E, et al. Inflammation and colorec- tal cancer, when microbiota - host mutualism break s. World J Gastroenterol 2014;20:908–22. 30. Meijers BK, Bammens B, De Moor B, Verbeke K, Vanrenterghem Y, Evenepoel P. Free p - cresol is associated with cardiovascular disease in hemodialysis patients. Kidney Int 2008;73:1174–80. 31. B ar reto FC , B ar reto DV, L iabeuf S, Europe an Uremic Toxin Wo r k Gro up (EU Tox). S er um in d ox y l s ul f a te i s a s s o ci a te d with vascular disease and mor tality in chronic kidney disease patients. Clin J Am Soc Nephrol 2009;4:1551–8. 32. Meijer s BK I, Clae s K , B ammens B, Henr iet te de Loor, et al. p - cresol and cardiovascular risk in mild -to - moderate kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol 2010;5:1182–9. 33. Meijers BK, De Preter V, Verbeke K, Vanrenterghem Y, Evenepoel P. p - Cre s yl sulf ate serum concentr ations in haemodialy sis patients are reduced by the prebiotic oligofructose- enriched inulin. Nephrol Dial Transplant 2010;25:219 -24. 34. Yokoyama MT, Carlson JR. Production of skatole and para - cresol by a Rumen L actobacillus sp. †Appl Environ Microbiol 1981;41:71– 6. 471 A r S T I T E A DUSKONN A A A S TA PÄ E V Eesti Arst 2018; 97(9):464–471 35. Sm i t h E A , M a c f a r l a n e G T. En um er a t i o n o f h um a n co l o n i c bacteria producing phenolic and indolic compounds: ef fects of pH, carbohydrate availabilit y and retention time on dissi - milator y aromatic amino acid metabolism. J A ppl Bac teriol 1996;81:288–302. 36. Tamm AO, V ija MP, Pihl VO, Kuusk IE. Biochemic al methods in control of the ef ficiency of oral antibacterial therapy. In: Human Gas trointes tinal Microf lor a. H.Bernhardt, M .K noke (Eds). Leipzig: JA Bar th Verlag; 1982:236 – 42. 37. Tamm AO, Siigur UH, Mikels aar ME. Vlijanie antibiotikov na kišetšnuju mikrofloru i produk tsiju metabolitov. Antibiotiki i himioterapija (Mosk va) 1989;34:409 –14. 38. Tamm A , Siigur U, Mikels aar M, V ija M. Output of bac terial metrabolites as a diagnostic means. Nahrung 1987;31:485–92. 39. Bakke OM. Studies on degradation of t yrosine by rat caecal contents. Scand J Gastroenterol 1969;4:603 –8. 40. K aur H, Das C, Mande SS. In Silico analy sis of putref ac tion pathways in bacteria and its implication in colorectal cancer. Front Microbiol 2017;8:2166. 41. Saito Y, Sato T, Nomoto K, Tsuji H. Identification of phenol- and p-cresol-producing intestinal bacteria by using media supple- mented with tyrosine and its metabolites. FEMS Microbiology Ecology 2018, doi: 10.1093/femsec/fiy125. 42. Shah VO, Townsend RR , Feldman HI, Pappan KL , Kensicki E, Vander Jagt DL . Pla sm a met abolomic prof ile s in dif ferent stages of CKD. Clin J Am Soc Nephrol 2013;8:363 –70. 43. Rhee EP, Clish CB, Ghorbani A , et al. A combined epidemiologic and metabolomic approach improves CKD prediction. J Am Soc Nephrol 2013;24:1330 –8. 4 4. Poe s en R , K aren W indey K , Ellen Neven E. T he Inf luence of CKD on colonic microbial metabolism. J A m Soc Nephrol 2016;27:1389 –99. 45. Vaziri ND, Wong J, Pahl M, et al. Chronic kidney disease alters intestinal microbial flora. Kidney Int 2013;83:308-15. 46. Ramezani A , Massy Z A , Meijers B, Evenepoel P, Vanholder R, R aj DS. Role of the gut microbiome in uremia: a potential therapeutic target. Am J Kidney Dis 2016 ;67:483 –98. 47. Nallu A, Sharma S, Ramezani A, Muralidharan J, Raj D. Gut micro- biome in chronic kidney disease: challenges and opportunities. Transl Res 2017;179:24 –37. 48. Hugon P, L agier JC, Rober t C, et al. Molecular studies neglect a p p aren tl y gr am - n e g a ti ve p o p ul a ti o n s in th e hum an gu t microbiota. J Clin Microbiol 2013;51:3286 –93. 49. Siezen RJ, Kleerebezem M. The human gut microbiome: are we our enterot ypes? Microb Biotechnol 2011;4:550 –3. 50. Fernandes R, do Rosario VA , Mocellin MC, Kuntz MGF, Trindade EBSM. Effects of inulin-type fructans, galacto - oligosacchari- des and related synbiotics on inflammator y markers in adult patients with over weight or obesity: A systematic review. Clin Nutr 2017;36:1197–206. 51. Nicolucci AC, Hume MP, Mar tínez I, Mayengbam S, Walter J, Reimer R A . Prebiotic s reduce body f at and alter intes tinal microbiota in children who are over weight or with obesit y. Gastroenterology 2017;153:711–22. 52. B a fe t a A , Koh M , Ri vero s C , R av aud P. H ar m s rep or tin g in r a n d o m i z e d c o n t r o l l e d t r i a l s o f i n t e r v e n t i o n s a i m e d a t modif ying microbiota: a systematic review. Ann Intern Med 2018;169:240 –7.