key: cord-018848-6kemhsyu authors: Stürenburg, Enno; Gässler, Norbert; Luppa, Peter B. title: Mikrobiologische Schnelltests und molekularbiologische Analytik date: 2011-12-17 journal: POCT - Patientennahe Labordiagnostik DOI: 10.1007/978-3-642-20172-1_11 sha: doc_id: 18848 cord_uid: 6kemhsyu Die meisten der derzeit am Markt verfügbaren mikrobiologischen Schnelltests basieren auf immunologischen Nachweisverfahren. Charakteristisch für alle immunologischen Verfahren ist, dass sie auf einer hochspezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion beruhen. Mittels dieses immunologischen Prinzips ist sowohl der qualitative Nachweis eines Analyten als auch die quantitative Bestimmung seiner Konzentration möglich. Der Testaufbau eines immunchemischen Tests kann besonders hinsichtlich der Entstehung und Auswertung der Testsignale erheblich variieren. Bewährte und für mikrobiologische Schnelltests häufig benutzte Formate sind die Partikelagglutination und die Immunchromatographie sowie die daraus hervorgegangenen Weiterentwicklungen, beispielsweise der optische Immunoassay. Auf Basis von Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (vor allem der Polymerase- Kettenreaktion, PCR) sind bislang nur wenige POC-Tests verfügbar; ihre Praktikabilität und Bewährung in der Praxis wird sich erst in den nächsten Jahren zeigen. Die meisten der derzeit am Markt verfügbaren mikrobiologischen Schnelltests basieren auf immunologischen Nachweisverfahren. Charakteristisch für alle immunologischen Verfahren ist, dass sie auf einer hochspezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion beruhen. Mittels dieses immunologischen Prinzips ist sowohl der qualitative Nachweis eines Analyten als auch die quantitative Bestimmung seiner Konzentration möglich. Der Testaufbau eines immunchemischen Tests kann besonders hinsichtlich der Entstehung und Auswertung der Testsignale erheblich variieren. Bewährte und für mikrobiologische Schnelltests häufig benutzte Formate sind die Partikelagglutination und die Immunchromatographie sowie die daraus hervorgegangenen Weiterentwicklungen, beispielsweise der optische Immunoassay. Auf Basis von Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (vor allem der Polymerase-Kettenreaktion, PCR) sind bislang nur wenige POC-Tests verfügbar; ihre Praktikabilität und Bewährung in der Praxis wird sich erst in den nächsten Jahren zeigen. Breiten Einsatz zum Nachweis mikrobieller Antigene in Körperflüssigkeiten haben Reaktionssysteme erlangt, bei denen Trägerpartikel mit einem Durchmesser von etwa 0,8 μm -meist solche aus Latex (Polystyrol) -mit spezifischen Antikörpern adsorptiv beladen werden. In Anwesenheit des mikrobiellen Antigens in der Patientenprobe werden diese Latexteilchen dann agglutiniert. Die Agglutination wird als Ausflockung der sonst homogen milchigen Suspension makroskopisch sichtbar. Partikelagglutinationstests können auf Objektträgern, auf Platten, in Röhrchen, in Kapillaren oder in Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Besonders zur Beschleunigung der Meningitisdiagnostik (Nachweise für Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis -Serovare A, B, C, Y und W135 -sowie Haemophilus influenzae Kapseltyp b verfügbar) sowie in der Rotavirusdiagnostik haben sich Latexreagenzien zum Antigennachweis gut bewährt. Daneben können zahlreiche andere mikrobielle Antigene auf diese Weise nachgewiesen werden. »Immunchromatographischer Test« (ICT), »Lateral Flow-Assay« (LFA), »Lateral Flow-Device« (LFD), »Dipstick-Assay« und »One-step-Test« sind die meistgebrauchten Namen, unter denen immunchromatographische Streifentests in der medizinischen Literatur zu finden sind. Diese Testverfahren basieren auf dem Immunkomplexprinzip, dass sich ein Antigen mit seinem spezifischen Antikörper zu einem Komplex verbindet. Zusätzlich jedoch nutzen solche Tests chromatographische Trennverfahren, da die Antikörper auf einer Membran immobilisiert sind, durch die die zu analysierende Probe (etwa Blut, Urin oder Liquor) aufgrund von Kapillarkräften gesogen wird [4] . ICT Gold Purpur Y Im konventionellen Blockcycler-Verfahren, das als Endpunktverfahren konzipiert wurde und den Anfang der PCR-Entwicklungsreihe markierte (⊡ Tab. 11.1), werden die vervielfältigten Genprodukte noch durch Hybridisierung mit Gen-Sonden oder interkalierenden Substanzen (z. B. Ethidiumbromid) sichtbar gemacht [2] . Das Auslesen der Signale erfolgt wahlweise im ELISA-Format (z. B. Hyplex Staphylo Resist, Fa. BAG Med, Greppen) oder durch Oligochromatographie (z. B. GenoType MRSA Direct, Fa. Hain Lifescience GmbH, Nehren). Nachteilig sind an den genannten Verfahren die aufwendigen manuellen Arbeitsschritte (also nicht POCT-fähig) sowie die Tatsache, dass das Arbeiten in einem offenen PCR-System durch das Verschleppen von Amplifikationsprodukten zwangsläufig mit einem Kontaminationsrisiko einhergeht [2] . Neben der Infektiologie gibt es vielfältige Anwendungen bei genetisch bedingten Erkrankungen und in der Forensik (»genetischer Fingerabdruck«). Eine entscheidende Weiterentwicklung gelang mit der sog. Real-Time-PCR (⊡ Tab. 11.1; [2] ). Vorteil dieser Vervielfältigungsmethode ist vor allem, dass das Amplifikationssignal durch während der PCR-Zyklen kontinuierlich durchgeführte Fluoreszenzmessungen quantifiziert wird. Das Reaktionsgefäß ⊡ Abb. 11.3 Prinzip der Polymerasekettenreaktion [5, 6, 7] ). Die zur Verfügung stehenden Reaktionskartuschen vereinen den gesamten Prozess des Probenaufschlusses (DNA-Extraktion), der Amplifikation und der Detektion in einem einzigen, geschlossenen Reaktionsgefäß, das mit wenigen Handgriffen beschickt werden kann. Die Abarbeitung der Kartuschen erfolgt in einem PCR-Vollautomaten (GeneXpert), der, einmal beschickt, den gesamten PCR-Prozess komplett eigenständig, d. h. ohne weiteres manuelles Zutun abarbeitet (»walk-away-Prinzip«) und nach insgesamt 60-120 min ausgewertet hat. Durch den integrierten Probenaufschluss sowie aufgrund der Tatsache, dass ein flexibles Nachladen von Kartuschen in parallelen Reaktionseinheiten möglich wurde (»random-access-Prinzip«), gelang mit diesem Gerät ein erster Schritt in Richtung patientennaher, rund um die Uhr verfügbarer Anwendungen von NATs. Derartige PCR-Tests könnten daher zukünftig alle Abstrichuntersuchungen ersetzen, bei denen zeitnahe Entscheidungen über die Einleitung einer bestimmten Therapie oder Isolierungsmaßnahme im Vordergrund stehen. Bei Fragestellungen, die weniger zeitkritisch sind, dürfte ein kultureller Nachweis in einem mikrobiologischen Labor vor allem angesichts der mit der PCR-Technik verbundenen höheren Kosten (derzeit 30-40 € pro Test) weiterhin Standard bleiben. Ob vor dem Hintergrund der notwendigen Verlagerung von Arbeitsprozessen eine komplette oder auch nur partielle Auslagerung der PCR-ditierten Laboratorien vorbehalten ist. Eine Einstufung als »CLIA waived«, d. h. eine Zulassung für ein breites Anwendungsgebiet ohne weitere Regularien, zeichnet sich nicht ab. Die Palette der zur Verfügung stehenden Einzeltest-Kartuschen im PCR-Format umfasst Tests zur Identifizierung von Infektions-und Krebserkrankungen im klinischen Bereich (z. B. MRSA, Gruppe B-Streptokokken, Enteroviren aus Liquor, Influenza, Clostridium difficile, BCR-ABL-Translokation bei der CML), Tests im Lebensmittel-, Landwirtschafts-und Umweltbereich, sowie Tests für die Identifizierung von für bioterroristische Zwecke eingesetzten Erregern (Bacillus anthracis; Kap. 22; [5, 6, 7] ). Da nicht nur die Identität der nachgewiesenen Erreger genetisch fixiert ist, sondern auch Resistenzdeterminanten oder Virulenzfaktoren auf molekularer Ebene repräsentiert sind, lassen sich mit entsprechend modifizierten PCR-Techniken (sog. Multiplex-Tests) mittlerweile auch mehrere Gennachweise in einem einzigen Testdurchlauf durchführen ( Kap. 22). Der Tuberkulose-Test des »GeneXpert« identifiziert nicht nur den Erreger, sondern weist darüber hinaus eine genetische Veränderung der Rifampicin-Resistenz, einem Marker für multiresistente Stämme von Tuberkulosebakterien (MDR-TB), nach ( Kap. 36). Ein weiteres Beispiel für einen Multiplex-Test ist der Clostridium difficile-Nachweis, der nicht nur das Bakterium selbst erkennt, sondern außerdem den »hypervirulenten« Stamm NAP1/O27 identifizieren kann. Weitere Unternehmen der In-vitro Diagnostik arbeiten derzeit an der Entwicklung ähnlicher POCT-geeigneter DNA-Amplifikations-und Detektionstechniken für NAT-Applikationen: ▬ Die Firma Nanosphere (Northbrook, IL, USA) nutzt in ihrem Verigene-System Gold-Nanopartikel mit immobilisierten kurzen Diese innovativen DNA/RNA-Vervielfältigungsverfahren sowie die zunehmende Test-Parallelität, die sich hier in ihren Anfängen abzeichnen, wird sicherlich auch die Zukunft der patientennahen Testung bestimmen. Eine neuere Generation von NATs mit noch stärkerer Parallelität wird antreten, um komplexe infektiologische Fragestellungen schnell und nah am Patienten zu beantworten. Ob die aufgezeigten Techniken jedoch den Anforderungen dieser Entwicklung gerecht werden können, ist fraglich. Denkbar ist, dass andere Plattformen mit höherer Informationsdichte (etwa die DNA-Chip-Technologie oder die Massenspektrometrie) hier nachfolgen und die PCR auf lange Sicht ablösen [1] . Zudem muss betont werden, dass bei allen mikrobiologischen und virologischen Nachweisverfahren eine Fachexpertise bzgl. der Interpretation der Ergebnisse eine unbedingte Voraussetzung darstellt. Daher werden auch in Zukunft die patientennah als NAT durchgeführten mikrobiologischen Schnelltests nur einen beschränkten Teil der mikrobiologischen und virologischen Gesamtdiagnostik ausmachen. Clinical microbiology in the year 2025 An enhanced optical immunoassay for the rapid detection of Neisseria gonorrhoeae from female endocervical swabs and male urine specimens. Produktbeilage, Revision 02 Entwicklung eines quantitativen Lateral-Flow-Immunoassays zum Nachweis von Analyten in geringsten Konzentrationen. Inauguraldissertation GeneXpert testing: applications for clinical microbiology, Part I. Clin Microbiol Newsletter 30 GeneXpert testing: applications for clinical microbiology, Part II Technology for automated, rapid, and quantitative PCR or reverse transcription-PCR clinical testing